To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.
Poisson zèbre adulte a une étonnante capacité à régénérer leur système nerveux central après une blessure. Pour étudier la réponse cellulaire et les mécanismes moléculaires impliqués dans le poisson zèbre adulte système nerveux central (SNC) de régénération et de réparation, nous avons développé un modèle de poisson zèbre de blessure de télencéphalique adulte.
Dans cette approche, nous générons manuellement une blessure en poussant une aiguille de seringue de l'insuline dans le télencéphale adulte poisson zèbre. À différents jours après des blessures, les poissons sont sacrifiés, leurs cerveaux sont disséqués et colorées par immunohistochimie et / ou hybridation in situ (ISH) avec des marqueurs appropriés pour observer la prolifération cellulaire, gliogénèse, et la neurogenèse. L'hémisphère non lésé controlatéral sert de contrôle interne. Cette méthode combinée par exemple avec de l'ARN séquençage profond peut aider à l'écran de nouveaux gènes jouant un rôle dans le poisson-zèbre neurogenèse télencéphale adulte, la régénération et la réparation.
Les mammifères ont une capacité très limitée de générer de nouveaux neurones à l'âge adulte, et la neurogenèse adulte dans le cerveau est le plus souvent limitée à deux régions télencéphaliques situés à la zone sous-ventriculaire (SVZ) des ventricules latéraux, et la zone sous-granulaire (SGZ) du denté gyrus dans l'hippocampe 1. Les mammifères peuvent également pas réparer les dommages du cerveau causée par les maladies neurodégénératives, accident vasculaire cérébral ou de blessures, de manière efficace. Neurones perdus ne sont pas remplacés, et à la place de la prolifération de différents types de cellules gliales, les astrocytes, notamment, la microglie et les oligodendrocytes, est observée. En conséquence de ce processus de prolifération appelé gliose réactionnelle, le tissu du cerveau lésé est rendu étanche par la formation d'une cicatrice gliale, qui inhibe la régénération axonale neuronale et 4.2.
Contrairement aux mammifères, les poissons téléostéens comme le poisson zèbre former de nouveaux neurones en abondance dans les stades adultes et ont une haute régénération et PROLIFÉRATive potentiel de réparer les lésions du système nerveux central 2,5-7. Le cerveau adulte de poisson zèbre contient 16 niches de cellules souches neurales distinctes qui génèrent un grand nombre de nouveaux neurones pendant toute la durée 8-11. Neurones nés dans ces zones de prolifération spécifiques du cerveau adulte de poisson zèbre migrent vers les zones cibles, où ils seront matures et s'intégrer dans les réseaux de neurones existants 8,10,12-15.
Parmi les zones progénitrices identifiés chez le poisson zèbre adulte, la zone ventriculaire télencéphalique est l'une des niches de cellules souches les plus étudiées neuronales. Les cellules de cette ancêtre niche peuvent être classés en trois types distincts quant à leur morphologie, le taux de division et d'expression de cellules gliales différent ou marqueurs neuronaux. Type I et de type II sont des cellules gliales radiales comme les cellules qui ont un long processus. Ils expriment des marqueurs de cellules souches, y compris GFAP, la nestine, et S100β. Type I cellules ne prolifèrent pas tandis que les cellules de type II PROLIFÉRATe lentement, comme en témoigne leur expression de marqueurs de prolifération tels que la prolifération cellulaire antigène nucléaire (PCNA) et l'incorporation d'analogues de désoxythymidine. Les cellules de type III sont en train de la division des cellules qui se sont engagés à devenir progéniteurs neuronaux et exprimer des gènes marqueurs neuronaux, comme PSA-NCAM 5,16.
Bien que les capacités de régénération de poissons téléostéens sont bien documentés, seules quelques publications ont décrit et étudié en détail les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régénération neuronale dans le télencéphale adulte à la suite d'une blessure 15,17-22. Pour décrypter les mécanismes impliqués dans le poisson zèbre adulte central régénération du système nerveux et de la réparation et de comprendre les similitudes et les différences entre la neurogenèse constitutive et de régénération, nous avons développé un modèle de poisson zèbre de blessure de télencéphalique adulte. Ici, nous allons décrire visuellement comment générer une blessure dans l'un des hemisph télencéphaliqueeres avec l'aide d'une aiguille de seringue, tout en maintenant le côté non lésé controlatéral comme témoin interne. Nous allons également montrer comment surveiller les changements sur blessure à la prolifération cellulaire et l'expression des gènes par immunohistochimie et dans des tests d'hybridation in situ.
Nous décrivons ici un procédé pour induire une blessure télencéphalique en poussant une aiguille à travers le crâne du poisson zèbre adulte, et pour analyser la réaction cellulaire et moléculaire de cette blessure par immunohistochimie et hybridation in situ. Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres approches existantes est sa simplicité, la rapidité et l'efficacité des coûts. Par conséquent, cette technique qui permet la production de nombreux cerveaux blessés dans un court laps de temps, peut être facilement combiné avec un écran de grande échelle hybridation in situ pour identifier des gènes ayant un rôle dans la régénération et la neurogenèse.
L'âge de poisson zèbre adulte sur lequel le dommage est effectuée est crucial. Si les poissons sont plus de 1,5 ans, le crâne est trop dur et il est possible que le crâne est poussé vers le bas ou fracturé plutôt que proprement perforé. En revanche, chez les jeunes poissons (moins de 4 mois), il reste encore beaucoup de neurogenèse se passe, ce qui pourrait lead des résultats faussement positifs en ce qui concerne la neurogenèse réactive.
Une autre étape cruciale de cette approche est de vérifier l'efficacité du coup de couteau et d'exclure que les deux hémisphères sont blessés. Ceci peut être contrôlé par coloration des sections avec l'anticorps anti-PCNA. Dans une lésion correctement mis en place, PCNA devrait être nettement régulée à la hausse dans un seul des hémisphères.
Il est important de garder à l'esprit que la blessure mécanique induite aura plusieurs effets secondaires tels que l'ablation non-spécifique cellulaire, la mort cellulaire accrue en raison de la dégénérescence secondaire, l'inflammation et la destruction de la barrière hémato-encéphalique, et les dégâts de zone ventriculaire et que un écoulement de conséquence possible du liquide céphalo-rachidien dans le parenchyme cérébral. Cependant, les poissons blessés semblent souffrir très peu de la blessure. Dans 2 minutes ils sont nage libre à nouveau et le comportement alimentaire normal est rétabli dans environ 4 heures. Après 3 semaines, l'ie préjudice est morphologiquement plus visible. Dans nos mains, de plusieurs centaines de chirurgies que nous n'avons pas perdu un seul poisson, malgré le fait que nous avions un taux de blessures à 100% tel qu'évalué par l'histologie à 5 jours après la lésion.
Dans les dernières années, d'autres techniques telles que les approches transgéniques ont été développés chez le poisson zèbre pour produire un tissu ou type de cellule ablation spécifique 2. Bien que ces techniques sont très élégant et peu invasive, ils sont basés sur la génération de constructions d'ADN complexes et la mise en place de plusieurs lignes de poisson zèbre transgénique stable qui peut être très long et fastidieux. Par conséquent, les approches mécaniques simples tels que l'analyse décrite dans ce protocole restent un outil important pour étudier la neurogenèse adulte cerveau et de la régénération.
The authors have nothing to disclose.
We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tricaine | Sigma | 335.2 | |
10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
Glass slides | Labonord | 5305103 | |
Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
Petri dishes 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
Falcons 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
Anti-GFP (1 :1000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
Vibratome VT1000S | Leica | ||
Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | 24 | ||
Danio rerio WT strains (e.g. AB2O2) |