To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.
יש לי דג הזברה מבוגר יכולת מדהימה להתחדש מערכת העצבים המרכזית שלהם לאחר פציעה. כדי לחקור את התגובה התאית והמנגנונים המולקולריים מעורבים בהתחדשות מבוגרת דג הזברה מערכת עצבים מרכזי (CNS) ותיקון, שפיתחנו מודל דג הזברה של פגיעת telencephalic מבוגרת.
בגישה זו, שאנו מייצרים באופן ידני על ידי לחיצת פגיעת מחט מזרק אינסולין לtelencephalon מבוגרת דג הזברה. בימים שלאחר פציעה שונות, דגים הקריבו, המוח שלהם הם גזורים החוצה ומוכתם על ידי אימונוהיסטוכימיה ו / או בכלאה באתר (ISH) עם סמנים מתאימים להתבונן התפשטות תאים, gliogenesis, ונוירוגנזה. חצי הכדור unlesioned הנגדי משמש כבקרה פנימית. שיטה זו בשילוב למשל עם רצף עמוק RNA יכול לעזור למסך לגנים חדשים עם תפקיד בנוירוגנזה telencephalon המבוגר, התחדשות, ותיקון דג הזברה.
ליונקים יש יכולת מוגבלת מאוד ליצירת תאי עצב חדש במהלך חיים בוגרים, ונוירוגנזה הבוגרת במוח בעיקר מוגבלת לשני אזורי telencephalic ממוקמים באזור subventricular (SVZ) של חדרים לרוחב, ואזור subgranular (SGZ) של משוננת gyrus בהיפוקמפוס 1. יונקים גם לא יכולים לתקן את הנזק במוח שנגרם על ידי מחלות ניווניות, שבץ, או פציעות, ביעילות. נוירונים שאבדו אינם מוחלפים ובמקום ריבוי סוגים שונים של תאי גליה, כוללים האסטרוציטים, מיקרוגלים, וoligodendrocytes של, הוא ציין. כתוצאה מתהליך השגשוג הזה שנקראת דבקה תגובתי, רקמת המוח נפגעה חסומה על ידי ההיווצרות של צלקת גליה, אשר מעכבת התחדשות עצבית וaxonal 2-4.
בניגוד ליונקים, דגי חוליות כמו דג הזברה ליצור נוירונים חדשים בשפע בשלבים בוגרים ויש לי משובי וproliferat גבוהיםive פוטנציאל לתיקון נגעים במערכת העצבים המרכזית 2,5-7. המוח מבוגר דג הזברה מכיל 16 נישות עצביות שונות בתאי גזע שיוצרות מספר רב של תאי עצב חדשים במהלך כל חיי 8-11. נוירונים שנולדו באזורי ההתפשטות הספציפיים אלה של מוח דג הזברה המבוגר להגר לאזורי היעד שלהם, שבו הם יבשילו ולהשתלב ברשתות עצביות קיימות 8,10,12-15.
בין אזורי האב שזוהו בדג זברה מבוגרת, אזור חדרית telencephalic הוא אחד מהנישות של תאי גזע עצביים הנחקרות ביותר. תאים בנישה של אב זה יכול להיות מסווג לשלושה סוגים ברורים לגבי המורפולוגיה, השיעור והביטוי של גליה שונה או סמנים עצביים החלוקה שלהם. אני סוג ותאי סוג II הם גליה רדיאלי כמו תאים שיש להם תהליכים ארוכים. הם מבטאים סמני תאי גזע כולל GFAP, nestin, וS100β. אני תאי סוג לא להתרבות ואילו הסוג השני תאים proliferatדואר לאט, כפי שמעיד ביטוים של סמני התפשטות כגון מתרבים אנטיגן התא גרעיני (PCNA) ושילוב של אנלוגים desoxythymidine. תאי III הסוג מהירים מתחלקים תאים שמחויבים להפכו אבות עצביים ולבטא גני סמן עצביים, כגון PSA-NCAM 5,16.
למרות יכולות התחדשות של דגי חוליות מתועדות היטב, רק כמה פרסומים שתיארו וחקרו בפירוט המנגנונים התאיים ומולקולריים מעורבים בהתחדשות עצבית בtelencephalon המבוגר בתגובה לפציעה 15,17-22. לפענח את המנגנונים מעורבים בהתחדשות דג הזברה מבוגרת של מערכת עצבים מרכזית ותיקון ולהבין את קווי דמיון ואת ההבדלים בין נוירוגנזה המכוננת ומשובים, פיתחנו מודל דג הזברה של פגיעת telencephalic מבוגרת. כאן, אנו מתארים באופן חזותי כיצד ליצור פגיעה באחד מhemisph telencephalicEres בעזרת מחט מזרק, תוך שמירה על צד unlesioned הנגדי כבקרה פנימית. אנחנו גם נציג כיצד לעקוב אחר שינויים על פציעה בשגשוג תאים וביטוי גנים על ידי אימונוהיסטוכימיה ובמבחני הכלאה באתר.
אנו מתארים כאן שיטה כדי לגרום לפגיעת telencephalic ידי דחיפת מחט דרך הגולגולת של דג הזברה המבוגר, ולנתח את התגובה התאית ומולקולרית לפגיעה זו על ידי אימונוהיסטוכימיה וכלאה באתרו. היתרון העיקרי של שיטה זו על פני גישות אחרות קיימות הוא הפשטות, מהירותו ויעילות כלכלית. לכן, בטכניקה זו, המאפשרת ייצור של מוח נפגע רבים בזמן קצר, יכולה להיות משולבת בקלות עם בקנה מידה גדולה במסך הכלאה באתר לזיהוי גנים בעלי תפקיד בהתחדשות ונוירוגנזה.
גיל דג הזברה המבוגר שבפגיעה מתבצעת הוא קריטי. אם הדגים ישנים יותר 1.5 שנים, הגולגולת היא קשה מדי וזה אפשרי, כי הגולגולת הוא נדחפה למטה או שבר ולא בצורה נקיה מחורר. לעומת זאת, בדגים צעירים (מתחת לגיל 4 חודשים), יש עדיין הרבה נוירוגנזה קורה, שאולי לאהד לתוצאות חיוביות כוזבות לגבי נוירוגנזה תגובתי.
עוד צעד קריטי בגישה זו הוא כדי לוודא את היעילות של פצע הדקירה וכדי לשלול כי שני ההמיספרות פצועים. זה יכול להיות במעקב על ידי צביעת החלקים עם הנוגדן אנטי PCNA. בנגע הציג בצורה נכונה, PCNA צריך להיות באופן משמעותי מוסדר למעלה רק באחת משתי מחציות המוח.
חשוב לזכור כי הפגיעה מכאנית המושרית תהיה כמה תופעות לוואי כגון אבלציה אינה ספציפית תא, מוות של תאים גדל בגלל ניוון המשני, דלקת והרס של מחסום דם המוח, ונזק של אזור חדרית וכמו זרימה אפשרית תוצאה של נוזל השדרה למוח parenchyma. עם זאת, הדגים הפצועים נראים סובלים מעט מאוד מהפציעה. תוך 2 דקות הם חייה שוב חופשית ונורמלית התנהגות האכלה משוחזרת בתוך כ 4 שעות. לאחר 3 שבועות injury הוא מורפולוגית אינה גלוי יותר. בידיים שלנו, מכמה מאה ניתוחים שאנחנו לא אבדנו את דג בודד למרות שהיו לנו שיעור פגיעה 100% כפי שהוערך על ידי היסטולוגיה ב 5 ימים לאחר נגע.
בשנים האחרונות טכניקות אחרות כגון גישות מהונדסים פותחו בדג הזברה לייצר רקמה או אבלציה סוג תא מסוימת 2. למרות שהשיטות אלה הן מאוד אלגנטיות ופולשנית שהם מבוססים על הדור של בונה DNA מסובכת והקמה של מספר קווים מהונדסים דג הזברה יציב אשר יכול להיות מאוד משעמם וזמן רב. לכן, גישות פשוטות מכאניות כגון assay שתואר בפרוטוקול זה יישאר כלי חשוב ללמוד נוירוגנזה מוח בוגרת והתחדשות.
The authors have nothing to disclose.
We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tricaine | Sigma | 335.2 | |
10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
Glass slides | Labonord | 5305103 | |
Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
Petri dishes 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
Falcons 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
Anti-GFP (1 :1000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
Vibratome VT1000S | Leica | ||
Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | 24 | ||
Danio rerio WT strains (e.g. AB2O2) |