To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.
Взрослый данио имеют удивительную способность к регенерации их центральную нервную систему после травмы. Для исследования клеточного ответа и молекулярные механизмы, вовлеченные в данио взрослого центральной нервной системы (ЦНС) регенерации и ремонта, мы разработали данио модель взрослого травмы конечного мозга.
При таком подходе мы вручную генерировать травмы, нажав инсулиновый шприц иглу в данио взрослого мозге. В разные дни после травмы, рыба умерщвляли, их мозг вырезали и окрашивали с помощью иммуногистохимии и / или в гибридизация (ISH) с соответствующими маркерами для наблюдения пролиферации клеток, глиогенеза и нейрогенез. Контралатеральной непораженный полушарие служит в качестве внутреннего контроля. Этот метод в сочетании, например, с РНК глубокой последовательности может помочь экране для новых генов с ролью в данио взрослых мозге нейрогенеза, регенерации и ремонта.
Млекопитающие имеют очень ограниченные возможности мобилизации новых нейронов во взрослой жизни, и взрослый нейрогенез в мозге, в основном, ограничивается двумя конечного мозга регионов, расположенных на субвентрикулярной зоне (SVZ) боковых желудочков, и под зернистым зона (SGZ) зубчатой извилины в гиппокампе 1. Млекопитающие также не может восстановить повреждения мозга, вызванного нейродегенеративных заболеваний, инсульта или травмы, эффективно. Потерянные нейроны не будут заменены, а вместо этого пролиферации различных типов глиальных клеток, в том числе астроцитов, микроглии и олигодендроцитов, не наблюдается. Как следствие этого пролиферативной процесса, называемого реактивного глиоз, раненых ткани мозга уплотнен образованием глиальных шрам, который ингибирует нейрональные и регенерацию аксонов 2-4.
В отличие от млекопитающих, костистых рыб, как данио сформировать новые нейроны в изобилии в взрослой стадии и имеют высокую регенеративные и proliferatив потенциал для ремонта поражения центральной нервной системы 2,5-7. Данио взрослый мозг содержит 16 различных нейронных ниши стволовых клеток, которые генерируют большое количество новых нейронов в течение всей жизни 8-11. Нейроны, рожденные в этих конкретных распространения зон взрослого данио мозга мигрируют в своих целевых районах, где они будут сроком погашения и интеграции в существующие нейронных сетей 8,10,12-15.
Среди предшественников зон, определенных в взрослых данио, зона конечного мозга желудочка является одним из наиболее изученных нервных стволовых клеток ниши. Клетки в этой нише предшественников могут быть классифицированы на три группы в отношении их морфологию, скорость деления и экспрессию различных глиальных или нейронных маркеров. Тип I и клетки типа II радиальные глии как клетки, которые имеют длинные процессы. Они выражают стволовых клеток маркеры, включая GFAP, нестина и S100β. Тип I клетки не размножаются в то время как клетки типа II proliferatэ медленно, о чем свидетельствует их выражения распространения маркеров, таких как пролиферирующих клеток ядерного антигена (PCNA) и включение desoxythymidine аналогов. Клетки III типа быстро делящихся клеток, которые привержены стать нервные клетки-предшественники и выразить нервные маркерных генов, таких как PSA-NCAM 5,16.
Хотя регенеративные мощности костистых рыб, хорошо документированы, всего в нескольких публикациях описаны и подробно исследовали клеточные и молекулярные механизмы, участвующие в регенерации нейронов во взрослом мозге в ответ на повреждение 15,17-22. Чтобы расшифровать механизмы, причастных к данио взрослого центральной нервной регенерации и восстановления системы и понять сходства и различия между конститутивной и регенеративной нейрогенеза, мы разработали данио модель взрослого травмы конечного мозга. Здесь мы опишем визуально, как генерировать травмы в одном из конечного мозга hemisphERES с помощью иглы шприца, при сохранении контралатеральной непораженный сторону в качестве внутреннего контроля. Мы также покажем, как контролировать изменения при травме в клеточной пролиферации и экспрессии генов с помощью иммуногистохимии и в гибридизация анализов.
Мы описываем здесь метод индуцировать конечного мозга травмы, нажав иглу через череп взрослого рыбок данио, и для анализа клеточной и молекулярной реакции на этой травмы по иммуногистохимии и в гибридизация. Основным преимуществом этого метода по сравнению с другими существующих подходов является его простота, скорость и эффективность затрат. Таким образом, эта техника, которая позволяет производство многих пострадавших мозги в течение короткого времени, может легко сочетаться с больших масштабах экране гибридизации месте в идентификации генов, с ролью в регенерации и нейрогенеза.
Возраст взрослых данио, по которому выполняется травма имеет решающее значение. Если рыба старше 1,5 лет, череп слишком сильно и не исключено, что череп толкают вниз или перелом, а не чисто перфорированная. В противоположность этому, в молодой рыбы (моложе 4 месяцев), есть еще много нейрогенеза происходит, что может Леаг к ложным положительным результатам в отношении реактивной нейрогенеза.
Другим важным шагом в этом подходе заключается в проверке эффективности колотой раны и исключить, что оба полушария ранены. Это можно контролировать путем окрашивания секции с антителом анти-PCNA. В правильно введена поражения, PCNA должна быть значительно выше, регулировать только в одном из полушарий.
Важно иметь в виду, что индуцированное механическая травма будет иметь несколько побочных эффектов, таких как неспецифический клеток абляции, повышенной гибели клеток из-за вторичной дегенерации, воспаления и разрушения гематоэнцефалического барьера, и повреждения зоны желудочка и как возможным последствием поток спинномозговой жидкости в паренхиме головного мозга. Тем не менее, поврежденные рыба по-видимому, страдают очень мало от травмы. В 2 мин они свободное плавание снова и нормальное пищевое поведение восстанавливается в течение примерно 4 часов. Через 3 недели яnjury морфологически не видно больше. В наших руках, от нескольких сотен операций мы не потеряли ни одной рыбы, несмотря на то, что мы имели уровень травматизма на 100% по оценке гистологии 5 дней после поражения.
В последние годы другие методы, такие как трансгенных подходов были разработаны в данио производить ткани или типа клетки конкретный абляции 2. Хотя эти методы являются очень элегантным и минимально инвазивной они основаны на генерации сложных конструкций ДНК и создание нескольких стабильных данио трансгенных линий, которые могут быть очень утомительным и трудоемким. Таким образом, простые механические подходы, такие как анализа, описанного в этом протоколе остаются важным инструментом для изучения нейрогенез мозга и регенерацию.
The authors have nothing to disclose.
We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tricaine | Sigma | 335.2 | |
10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
Glass slides | Labonord | 5305103 | |
Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
Petri dishes 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
Falcons 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
Anti-GFP (1 :1000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
Vibratome VT1000S | Leica | ||
Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | 24 | ||
Danio rerio WT strains (e.g. AB2O2) |