To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.
Yetişkin Zebrafish yaralanmadan sonra kendi merkezi sinir sistemini yenilemek için inanılmaz bir kapasiteye sahiptir. Hücresel yanıtı ve zebra balığı erişkin merkezi sinir sistemi (MSS) rejenerasyon ve onarım dahil moleküler mekanizmalarının araştırılması, biz yetişkin telencephalic yaralanma Zebra balığı model geliştirdi.
Bu yaklaşımda, elle zebrabalıkları yetişkin telencephalon içine bir insülin şırınga iğnesi iterek bir yaralanma oluşturur. Farklı sonrası yaralanma günlerde, balık beyinleri disseke ve hücre çoğalması, gliogenesis, ve nöron gözlemlemek için uygun işaretleri ile immünohistokimyasal ve / veya in situ hibridizasyon (ISH) Yazan lekeli, kurban edilmiştir. Kontralateral lezyonsuz yarıküre bir iç kontrol olarak hizmet vermektedir. RNA derin sıralama ile örneğin birlikte bu yöntem Zebrafish yetişkin telencephalon nöron, yenilenme ve tamir bir rolü olan yeni genlerin taranması için yardımcı olabilir.
Memeliler yetişkin hayatı boyunca yeni nöronlar oluşturmak için çok sınırlı bir kapasiteye sahip ve beyinde yetişkin nöron çoğunlukla lateral ventriküllerin subventricular bölgesi (SVZ) yer alan iki telencephalic bölgelere sınırlıdır ve dentatus bir subgranular bölgesi (SGZ) Hipokampta 1 gyrus. Memeliler da verimli, nörodejeneratif hastalıklar, inme, ya da yaralanma nedeniyle beyin hasarı tamir edemez. Kayıp nöronlar değiştirilmemiştir ve astrositler, mikroglia ve oligodendrosit glial hücreler de dahil olmak üzere farklı, yerine çoğalması gözlenir. Reaktif gliyoz denilen bu proliferatif işlemin bir sonucu olarak, zarar gören beyin dokusu nöronal ve aksonal rejenerasyonu 2-4 önleyen bir glial yara izi, oluşumu ile yalıtılmıştır.
Memeliler, teleost balık aksine Zebra balığı gibi yetişkin dönemlerinde bol miktarda yeni nöronlar oluşturmak ve yüksek rejeneratif ve proliferat varmerkezi sinir sistemi 2,5-7 lezyonlarını onarmak için potansiyel ive. Zebra balığı yetişkin beyin tüm yaşam 8-11 boyunca yeni nöronlar çok sayıda oluşturmak 16 farklı nöral kök hücre nişler bulunmaktadır. Yetişkin zebrabalıkları beynin bu özel çoğalması bölgelerde doğan nöronlar olgun ve mevcut nöron ağları 8,10,12-15 entegre olacak onların hedef alanlar, göç.
Yetişkin zebrabalıkları tespit progenitör bölgeleri arasında, telencephalic ventriküler zon en çok çalışılan nöronal kök hücre niş biridir. Bu progenitör niş hücreler kendi morfolojisi, bölünme oranı ve farklı glial veya nöronal markerlerin ekspresyonu ile ilgili olarak, üç ayrı tipte sınıflandırılabilir. Tip I ve tip II hücrelerin uzun süreçleri var hücreleri gibi radyal glial vardır. Onlar GFAP'ye, Nestin ve S100β dahil kök hücreleri işaretleri ifade. Tip II hücrelerin proliferat ederken hücreler çoğalmaya yok yazıne yavaş yavaş, hücre çekirdeği antijeni (PCNA) ile desoxythymidine analoglarının birleşme çoğalan olarak çoğalma markerlerin bunların ifadesi ile kanıtlanmıştır. Tip III hücreleri hızlı sinir atalarıdır olmak ve bu PSA-NCAM 5,16 olarak nöral işaretleyici genleri ifade kararlıyız bölünen hücreler vardır.
Teleost balık rejeneratif kapasitelerinin iyi belgelenmiş olmakla birlikte, sadece az sayıda yayın yaralanma 15,17-22 tepki olarak yetişkin telencephalon nöronal rejenerasyon dahil hücresel ve moleküler mekanizmaları tarif edilen ve detaylı bir şekilde araştırılmıştır. Zebra balığı erişkin merkezi sinir sistemi yenilenme ve tamir karıştığı mekanizmalarını deşifre etmek ve bünye ve rejeneratif nöron arasındaki benzerlikleri ve farklılıkları anlamak için, biz yetişkin telencephalic yaralanma Zebra balığı model geliştirdi. Burada, biz telencephalic hemisph birinde bir yaralanma oluşturmak için görsel nasıl anlatacağızbir şırınga iğnesi yardımıyla eres, bir iç kontrol olarak kontralateral lezyonsuz yan tutarken. Biz de hücre çoğalması ve immünhistokimya gen ifadesinde ve in situ hibridizasyon deneylerinde yaralanması üzerine değişiklikleri izlemek için nasıl göstereceğim.
Biz burada yetişkin zebrafish kafatası yoluyla bir iğne iterek bir telencephalic hasara yol için, ve immünhistokimya ve in situ hibridizasyon bu yaralanma hücresel ve moleküler tepki analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Mevcut diğer yaklaşımlar üzerinde bu tekniğin ana avantajı basitlik, hız ve maliyet verimliliği. Bu yüzden, kısa bir süre içinde bir çok yaralı beyinlerin üretimine olanak sağlar, bu teknik, kolayca rejenerasyon ve nöron bir rol ile genleri tanımlamak için in situ hibridizasyon ekranında bir büyük ölçekli kombine edilebilir.
Yaralanma gerçekleştirildiği yetişkin zebrabalıkları yaşı önemlidir. Balık 1,5 yıl daha yaşlı iseniz, kafatası çok zor olduğunu ve kafatası aşağı itti doğrusu temiz delikli daha kırık olma ihtimali vardır. Buna karşılık, küçük balıklar (küçük 4 ay) devam nöron bir sürü hala var olduğu olabilir leareaktif nöron ilgili yanlış pozitif sonuçlar d.
Bu yaklaşımın bir diğer kritik adım bıçak yarasının etkinliğini doğrulamak için ve iki yarım küresi yaralı olduğunu dışlamak için. Bu, anti-PCNA antikoru ile bölümleri boyama ile izlenebilir. Bir doğru tanıttı lezyonda, PCNA yarıkürelerinin sadece bir up-regüle anlamlı olmalıdır.
Bu kaynaklı mekanik yaralanma gibi non-spesifik hücre ablasyon, çünkü ikincil dejenerasyon, inflamasyon ve kan-beyin bariyerinin yıkılması artan hücre ölümü, ve ventriküler bölgesi hasar gibi ve gibi çeşitli yan etkileri olacağı akılda önemlidir beyin parankimi içine beyin omurilik sıvısının olası bir sonucudur akışı. Ancak, yaralı balık yaralanma çok az muzdarip görünüyor. 2 dakika içinde tekrar ücretsiz yüzme ve normal beslenme davranışı yaklaşık 4 saat içinde geri yüklenir. 3 hafta sonra, injury artık morfolojik görünür değil. Bizim ellerde, birkaç yüz ameliyatları biz 5 gün sonrası lezyon de histoloji tarafından değerlendirilen biz% 100 yaralanma oranına sahip olmasına rağmen, tek bir balık kaybetmedim.
Son yıllarda, bu tür transjenik yaklaşımlar gibi başka teknikler de doku veya hücre tipi özel ablasyon 2 üretmek üzere zebrabalıkları geliştirilmiştir. Bu teknikler çok zarif ve minimal invaziv olmalarına rağmen karmaşık DNA yapıları ve çok sıkıcı ve zaman alıcı olabilir birkaç istikrarlı Zebrafish transgenik hatların kurulması nesil dayanmaktadır. Dolayısıyla, bu protokol açıklanan deneyi gibi basit mekanik yaklaşımlar yetişkin beyin nöron ve rejenerasyon çalışması için önemli bir araç olmaya devam etmektedir.
The authors have nothing to disclose.
We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tricaine | Sigma | 335.2 | |
10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
Glass slides | Labonord | 5305103 | |
Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
Petri dishes 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
Falcons 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
Anti-GFP (1 :1000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
Vibratome VT1000S | Leica | ||
Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | 24 | ||
Danio rerio WT strains (e.g. AB2O2) |