À haut débit de dosage de phénotype<em> Salmonella enterica</em> Association Typhimurium, Invasion, et la réplication dans les macrophages
Summary
Une analyse à haut débit de Salmonella in vitro du phénotype bactérien ou autre association, l'invasion et la réplication dans les cellules phagocytaires avec une grande capacité de débit a été développé. La méthode a été utilisée pour évaluer Salmonella gène knock-out souches mutantes pour leur implication dans les interactions hôte-pathogène.
Abstract
espèces de Salmonella sont des agents pathogènes zoonotiques et principales causes de maladies d'origine alimentaire chez les humains et le bétail 1. La compréhension des mécanismes sous-jacents aux interactions Salmonella de sont importants pour élucider la pathogenèse moléculaire des infections à Salmonella. Le dosage de la protection de gentamicine au phénotype association de Salmonella, l'invasion et la réplication dans les cellules phagocytaires a été adapté pour permettre le criblage à haut débit de définir les rôles des mutants de délétion de Salmonella enterica sérotype Typhimurium dans les interactions hôte à l'aide de RAW 264.7 macrophages murins. Dans ce protocole, la variance dans la mesure est considérablement réduite par rapport au protocole standard, parce que de type sauvage et des souches mutantes multiples peuvent être testés dans la même boîte de culture et dans le même temps. L'utilisation de pipettes multicanaux augmente le débit et améliore la précision. En outre, les préoccupations liées à l'utilisation de moins host cellules par puits dans 96 puits boîte de culture ont été abordés. Ici, le protocole de l'essai in vitro Salmonella modifié d'invasion en utilisant des cellules phagocytaires a été employée avec succès à phénotype 38 mutants individuels Salmonella de suppression d'association, l'invasion et la réplication intracellulaire. Les phénotypes in vitro sont présentées, dont certaines ont été confirmés par la suite avoir des phénotypes in vivo dans un modèle animal. Ainsi, l', test normalisé modifié au phénotype Salmonella association, l'invasion et la réplication dans les macrophages avec une grande capacité de débit pourrait être utilisé plus largement pour étudier les interactions bactéries-hôtes.
Introduction
Salmonella non typhoïdique, sont des causes importantes de maladies entériques dans tous les vertébrés. La salmonellose chez l'homme est parmi les maladies d'origine alimentaire bactériennes top 1. Caractérisation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions de Salmonella avec leurs hôtes animaux se fait principalement à travers l'étude de Salmonella enterica sérotype Typhimurium (STM) en culture de tissus et des modèles animaux d'infection. Obtenir un aperçu des interactions hôtes-STM va nous aider à comprendre comment la bactérie Salmonella survivre et se développer à l'intérieur des cellules hôtes. Le premier défi dans l'étude de ces interactions est d'identifier autant de facteurs participant que possible à la fois l'hôte et l'agent pathogène, mais ces efforts sont largement entravée par les difficultés importantes de faire face à deux systèmes biologiques complexes indépendants simultanément, c'est-à-hôte et Salmonella, dans des conditions physiologiques. De plus, la grande repertoire de Salmonella et de gènes de l'hôte facteurs impliqués dans les interactions hôte codant potentiellement nécessitent plate-forme biologique à haut débit pour relever ce défi.
A, test normalisé modifié au phénotype association de Salmonella, l'invasion et la réplication dans les macrophages avec une grande capacité de débit a été développé pour examiner un grand nombre de gènes susceptibles d'engagement dans les interactions Salmonella de. Le test de protection de gentamicine a été développé en 1973 2, mais a d'abord été décrit en détail par Elsinghorst 3,4 à 1994. Il est maintenant devenu un outil standard pour l'étude de nombreuses bactéries pathogènes intracellulaires ex vivo, y compris Salmonella 5,6. Bactéries internalisées éviter d'être tués par des antibiotiques tels que la gentamicine, qui ne peuvent pas pénétrer les cellules eucaryotes 3. En tirant parti de ce phénomène, l'essai de protection gentamicine mesure la survie et la croissance de ba intracellulairepathogènes cterial. Trois événements au cours de l'infection, c'est à dire, d'une association avec les cellules eucaryotes, l'invasion et la replication, peuvent être évalués pour les bactéries pathogènes intracellulaires en fonction de l'intervalle de temps entre l'infection, le traitement de gentamicine, et une nouvelle incubation (Figure 1). Lignées de cellules eucaryotes offrent un environnement physiologique qui est moins complexe que les modèles animaux pertinents pour les études d'interaction hôte-pathogène.
Le test de protection gentamicine est une plate-forme appropriée pour étudier les interactions STM-hôtes, mais le dosage standard dans une boîte de culture de 24 puits a une capacité faible débit. Analyse informatique des ensembles de données in vivo identifié 149 produits de gènes de Salmonella qui sont prévus pour interagir avec environ 300 produits de gènes de l'hôte (données non publiées). Le dosage standard de protection gentamicine n'a pas la capacité de ce phénotype nombre de mutants de manière efficace.
Dans suppion, l'essai de protection de gentamicine peut théoriquement détecter l'invasion d'un seul bactérie. En raison de cette sensibilité inhérente, les données brutes sont sensibles à des variations lors de techniques répété à des moments différents. Les contrôles internes et rapport de présentation des données après normalisation sont indispensables pour l'interprétation des résultats soit valable. Compte tenu de ces considérations, un test de protection gentamicine normalisé modifié a été développé pour améliorer la capacité de contrôle et d'augmenter la précision.
Le protocole suivant est détaillée et illustrée pour effectuer le test de protection à la gentamicine modifié en utilisant des boîtes de culture à 96 puits et la lignée cellulaire de macrophages murins RAW264.7 d'. Par rapport au protocole standard dans des boîtes de culture de 24 puits, le protocole modifié présente les avantages suivants: 1) À l'aide des boîtes de culture de 96 puits permet jusqu'à 10 souches mutantes différentes à phénotypées y compris les contrôles positifs et négatifs internes avec une puissance statistique suffisante;2) La différence de résultats est considérablement réduit, car les mutants sont testés dans la même boîte de culture et, en même temps; 3) L'utilisation de pipettes multicanaux augmente le débit tout en réduisant la fatigue de l'opérateur. Enfin, la comparaison des boîtes de culture de 24 puits, les préoccupations de moins de cellules hôtes par puits dans 96 puits boîte de culture ont été abordées grâce à l'optimisation du protocole et de la normalisation.
En résumé, la modification, essai normalisée pour in vitro Salmonella phénotype ou autre association bactérienne, l'invasion et la réplication dans les cellules phagocytaires augmente la précision et réalise capacité à haut débit tout en réduisant la fatigue de l'opérateur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le test de protection gentamicine est largement utilisée pour étudier l'invasion et la réplication des bactéries pathogènes intracellulaires intérieur cellule hôte, et c'est surtout un outil biologique important pour l'étude des agents pathogènes, comme la salmonelle, dont l'invasion est l'étape préalable à l'établissement infection 1. La protection dosage standard de gentamicine dans la communauté de recherche Salmonella est mis en œuvre dans 24 puits …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été soutenu en partie par une subvention pour les National Institutes of Health NIAID (pour AJB et LGA, R01 AI076246). La collection de mutants de Salmonella a été financé en partie par les Instituts nationaux de la santé (subventions pour MM, U01 A152237-05, R01, R01 AI07397-01 AI039557-11 et R01 AI075093-01), en partie par les Instituts nationaux de subventions de la santé (pour HAP, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Nous remercions Steffen Prowollik pour réplique de placage et de confirmer les mutants de la collection.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 cell culture flask vented filter cap | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100X Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353086 | |
| 96-well cell culture plate | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH7.4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamycin solution | Sigma | K0254 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 |
Riferimenti
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