Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.
La adhesión célula-célula es fundamental a la vida multicelular y está mediada por una serie diversa de proteínas de la superficie celular. Sin embargo, las interacciones adhesivas para muchas de estas proteínas son poco conocidos. Aquí se presenta un método simple, rápido para la caracterización de las propiedades adhesivas de moléculas de adhesión celular homofílicas putativos. Células HEK293 cultivadas se transfectaron con el plásmido de ADN que codifica un secretada, ectodominio epítopo de etiquetado de una proteína de la superficie celular. El uso de perlas funcionalizados específicos para la etiqueta de epítopo, la proteína de fusión soluble, secretada es capturada del medio de cultivo. Las perlas recubiertas se pueden utilizar directamente en ensayos de agregación de talón o en grano fluorescente de clasificación ensayos para probar la adhesión homophilic. Si se desea, la mutagénesis se puede entonces utilizar para dilucidar los aminoácidos o dominios específicos requeridos para la adhesión. Este ensayo requiere sólo pequeñas cantidades de proteína expresada, no requiere la producción de líneas celulares estables, y se puede ACCOmplished en 4 días.
Adhesión célula-célula es esencial para el desarrollo y la integridad de los organismos multicelulares y es mediada por un conjunto diverso de moléculas de superficie celular. Muchas de estas moléculas de adhesión se han identificado y caracterizado, aunque muchos aún no se han descubierto. Se utilizan varios métodos para investigar las propiedades de las moléculas de adhesión celular (CAMs), incluyendo ensayos de clasificación de células, ensayos de agregación celular 1-8 y métodos biofísicos, tales como la microscopía de fuerza atómica y espectroscopía de fuerza de superficie 9-12.
La complejidad de incluso simplificada en sistemas in vitro utilizando líneas celulares hace que sea difícil determinar las propiedades adhesivas de una CAM putativo. Típicamente, una molécula se considera una CAM si induce la agregación de células cuando se transfecta en una línea celular no adhesiva. Sin embargo, está claro que esto no es evidencia directa de la actividad de adhesivo. Por ejemplo, facilitar la entrega de la superficie celular o la estabilidad de unCAM también se traduciría en un aumento de la agregación de células 1,13. Por otra parte, una verdadera CAM puede fallar para mediar en la agregación de células si la línea celular carece de otros co-factores necesarios para la entrega de la superficie celular o la estabilización.
Para evitar estos factores que complican, los ensayos más directos pueden ser empleadas que se basan en la idea de que las interacciones adhesivas deben ser una propiedad bioquímica intrínseca del dominio extracelular. Mientras que los granos fueron utilizados inicialmente para caracterizar Ng-CAM 2, estos ensayos se han ampliado con el fin de investigar la adhesión mediada por cadherina 12,14,15. Uso de fusión de las fusiones C-cadherina ectodominio-Fc, el laboratorio Gumbiner mostró que múltiples repeticiones de cadherina contribuyen a las interacciones homofílicas 14. Usando ensayos de agregación del grano comparables, E-cadherina y de adhesión N-cadherina también se han caracterizado 12,15, como tener un número de protocadherins 1,15-18 e isoformas Dscam de Drosophila <em> 19. Aquí se describe un ensayo relativamente simple y rápido para la caracterización de la actividad adhesiva de secretadas, ectodominios etiquetadas con epítopo de CAMs homofílicas putativo (Figura 1). Hemos usado este ensayo principalmente para caracterizar los miembros de la superfamilia de cadherina.
La adhesión celular es una característica esencial de la vida multicelular y está mediada por una amplia gama de proteínas de la superficie celular. De estos, se entienden las propiedades adhesivas detalladas por sólo una proporción relativamente pequeña. Aquí, hemos descrito un protocolo sencillo y rápido para la investigación de la capacidad adhesiva homophilic de ectodominios secretadas fusionados con un cómodo marcador de epítopo. Este enfoque tiene una serie de ventajas importantes. En primer lugar, no …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by an NSF/ARRA award (IOS 0920357) and an award from the NIH (5R21MH098463).
Name of Material/ Equipment | Catalog Number | Company |
pFc-N1 plasmid | To be submitted | Addgene |
HEK293 cells | CRL-1573 | American Type Culture Collection |
DMEM | 10-013-CV | Mediatech – Corning |
Fetal Bovine Serum (FBS) | F2442 | Sigma |
100X Pen-Strep (10,000 U/ml) | 15140-122 | Life Technologies |
0.05% Trypsin-EDTA | 25300054 | Life Technologies |
Lipofectamine 2000 | 11668030 | Life Technologies |
Dynabeads – Protein G | 10003D | Life Technologies |
Bovine Serum Albumin | A3294 | Sigma |
Depression slides | 71878-06 | Electron Microscopy Sciences |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | UFC901024 | Millipore |
0.45mm syringe filter | 83.1826 | Sarstedt |
Dynamag-2 Magnet | 12321D | Life Technologies |
Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | |
Table of Buffers/Solutions | ||
Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4°C. |
Growth Media – FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4°C. |
Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. |