Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.
Celle-celle adhesjon er grunnleggende for flercellet liv og formidles av et variert utvalg av celleoverflateproteiner. Imidlertid er de adhesive interaksjoner for mange av disse proteiner dårlig forstått. Her presenterer vi en enkel, rask metode for å karakterisere klebende egenskaper antatte homofilist celleadhesjonsmolekyler. Dyrkede HEK293-celler transfektert med plasmid DNA som koder for et utskilt, epitop-tagget ektodomenet av et celleoverflateprotein. Ved hjelp av funksjon perler spesifikke for epitop tag, er løselig, utskilt fusjonsprotein tatt fra kulturmediet. De belagte perler kan så brukes direkte i bead aggregering assays eller fluorescerende vulsten sortering assays for å teste for homofilist adhesjon. Hvis ønskelig, kan mutagenese deretter benyttes for å belyse de spesifikke aminosyrer eller domener som kreves for adhesjon. Denne assay krever bare små mengder av uttrykt protein, ikke krever produksjon av stabile cellelinjer, og kan ACCOmplished i 4 dager.
Celle-celle adhesjon er avgjørende for utvikling og integriteten til flercellede organismer, og er formidlet av et variert utvalg av celleoverflatemolekyler. Mange av disse adhesjonsmolekyler har blitt identifisert og karakterisert, men mange gjenstår å bli oppdaget. Flere metoder blir brukt for å undersøke egenskapene for celleadhesjonsmolekyler (kammene), inkludert cellesorteringsanalyser, celle aggregering assays 1-8 og biofysiske metoder, slik som atomic force microscopy og overflatekraft-spektroskopi 9-12.
Kompleksiteten selv forenklet in vitro systemer ved hjelp av cellelinjer gjør det vanskelig å fastslå klebende egenskaper en antatt CAM. Typisk blir et molekyl betraktet som en CAM celle dersom den induserer aggregering når transfektert inn i en ikke-klebende cellelinje. Imidlertid er det klart at dette ikke er direkte bevis for klebe aktivitet. For eksempel, å lette celleoverflaten levering eller stabiliteten i enCAM vil også føre til økt celle aggregering 1,13. Videre kan en sann CAM mislykkes i å mediere celle aggregering hvis cellelinjen mangler andre ko-faktorer som er nødvendige for celleoverflaten eller stabilisering levering.
For å unngå disse kompliserende faktorer, mer direkte analyser kan anvendes som er basert på ideen om at adhesive interaksjoner bør være en iboende egenskap ved biokjemisk det ekstracellulære domene. Mens perler ble opprinnelig brukt til å karakterisere Ng-CAM 2, har disse analysene blitt utvidet for å undersøke cadherin-mediert vedheft 12,14,15. Ved hjelp av fusjon av C-cadherin ektodomenet-Fc fusjoner, den Gumbiner lab viste at flere cadherin gjentar bidra til homofilist interaksjoner 14. Ved hjelp av sammenlignbare perle aggregering analyser, E-cadherin og N-cadherin vedheft har også vært preget 12,15, som har en rekke protocadherins 1,15-18 og Dscam isoformer fra Drosophila <em> 19. Her beskriver vi en relativt enkel og hurtig assay for å karakterisere den klebende aktiviteten av utskilte, epitop-tagget ectodomains av putative homofilist CAM (figur 1). Vi har brukt dette assay primært for å karakterisere medlemmer av superfamilien cadherin.
Celle adhesjon er en viktig funksjon av flercellet liv og formidles av et bredt spekter av celleoverflateproteiner. Av disse er de detaljerte klebeegenskaper forstås for bare en forholdsvis liten andel. Her har vi beskrevet en enkel, rask protokoll for å undersøke homofilist limet kapasitet skilles ectodomains smeltet til en praktisk epitope tag. Denne tilnærmingen har en rekke viktige fordeler. For det første er stabile cellelinjer ikke nødvendig 14,20, som tilstrekkelige mengder av protein kan bli gen…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by an NSF/ARRA award (IOS 0920357) and an award from the NIH (5R21MH098463).
Name of Material/ Equipment | Catalog Number | Company |
pFc-N1 plasmid | To be submitted | Addgene |
HEK293 cells | CRL-1573 | American Type Culture Collection |
DMEM | 10-013-CV | Mediatech – Corning |
Fetal Bovine Serum (FBS) | F2442 | Sigma |
100X Pen-Strep (10,000 U/ml) | 15140-122 | Life Technologies |
0.05% Trypsin-EDTA | 25300054 | Life Technologies |
Lipofectamine 2000 | 11668030 | Life Technologies |
Dynabeads – Protein G | 10003D | Life Technologies |
Bovine Serum Albumin | A3294 | Sigma |
Depression slides | 71878-06 | Electron Microscopy Sciences |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | UFC901024 | Millipore |
0.45mm syringe filter | 83.1826 | Sarstedt |
Dynamag-2 Magnet | 12321D | Life Technologies |
Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | |
Table of Buffers/Solutions | ||
Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4°C. |
Growth Media – FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4°C. |
Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. |