JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

Modellering Astrocytoma Pathogenesis<em> In Vitro</em> Och<em> In Vivo</em> Använda Kortikal Astrocyter eller neurala stamceller från Villkorlig, Genmanipulerade möss

Published: August 12, 2014
doi:
10.3791/51763
, , , , , , , ,
1Department of Pathology and Laboratory Medicine,University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center,University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine,University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology,University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program,University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology,Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center,University of North Carolina School of Medicine

Summary

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Abstract

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Introduction

Astrocytom är den vanligaste primära hjärntumör och glioblastom (GBM), en klass IV astrocytom, är den vanligaste och aggressiva subtyp med en medianöverlevnad på 12-15 månader 1,2. Invasion av diffusa astrocytom, särskilt GBM, utesluter komplett kirurgisk resektion, begränsar effektiviteten av adjuvant terapi, och oundvikligen leder till efterbehandling återfall 3. Patienter som ursprungligen före antingen med de novo (primär) GBM eller med lägre kvalitet astrocytom som oundvikligen utvecklas till (sekundär) GBM 4. GBM är genomiskt heterogen och präglas av ömsesidigt uteslutande och samarbete förekommer mutationer i gener som styr tre centrala signalvägar: G 1 / S (Rb) cellcykel checkpoint, receptor (RTK) och TP53 spridningsvägar 5-7. GBM består av fyra genomiska subtyper med skilda uttryck profiler som liknar olika hjärncelltyper, vilket tyder på att GBM subtyp är influpåverkades av dess cellursprungs 6,8,9. Bättre astrocytom modeller krävs för att definiera rollen av specifika kombinationer av mutationer i specifika celltyper under astrocytom patogenes. Utnyttja dessa modeller för effektivare preklinisk läkemedelsutveckling kommer i slutändan bidra till att förbättra behandlingsresultat. Nuvarande astrocytom modeller har etablerat humana cellinjer, patient härledda xenotransplantat (PDX), genmodifierade normala mänskliga astrocyter och neurala stamceller (NSC) och genetiskt modifierade möss (GEM) 10-14. Vi utvecklade ett alternativt, icke-könsceller GEM (nGEM) modell 15 som använder primära hjärnceller – kortikala astrocyter och NSC – skördas från GEM hyser olika kombinationer av floxed onkogena alleler. Målet var att skapa astrocytom modeller med genetiskt definierade celler som kan fenotypiskt kännetecknas både in vitro och in vivo och potentiellt utnyttjas för preklinisk läkemedelsutveckling i immune kompetenta möss.

Etablerade humana cellinjer är den vanligast använda modellen av astrocytom patogenes och läkemedelssvar in vitro och in vivo. De är tekniskt rakt framåt, allmänt tillgängliga, och har definierat kinetik och tumorigenicitet upon orthotopic xenografting i immundefekta möss 10,11,16-18 . Deras nackdelar inkluderar oförmåga att generera etablerade cellinjer från låggradig astrocytom, begränsar studien endast höggradig astrocytom; Avsaknaden av en definierad cell ursprungs; förekomsten av komplexa genomiska avvikelser, ofta med genomiska profiler som skiljer sig markant från det ursprungliga patientprovet; och känslighet för fenotypisk och genotypisk Avvikelsen under seriekulturen i serum 11,17,19-22. De fenotypiska konsekvenserna av enskilda onkogena mutationer i etablerade humana GBM cellinjer kan maskeras av de många avvikelser som faktiskt före, som ofta utesluter elucsolideringen av direkta genotyp-fenotyp konsekvenser.

PDX genereras genom subkutan passage av patient isolerade astrocytomceller i immundefekta möss eller genom sin kultur som icke-vidhäftande sfäroider i definierat, serumfritt medium före orthotopic injektion i hjärnan hos immundefekta möss 12,23. PDX behålla mer exakt genom-landskap av mänskliga astrocytom, men liknar etablerade humana cellinjer, kan den fenotypiska effekten av enskilda onkogena mutationer maskeras på grund av deras genomiska komplexitet 19,24. För att definiera de fenotypiska konsekvenserna av specifika onkogena mutationer, i synnerhet som svar på nya terapier, är paneler av etablerade humana cellinjer eller PDX ofta utnyttjas för att fastställa genotyp-fenotyp korrelationer, visar generaliserbarhet, och minimera sannolikheten för cell-linjespecifika effekter. Medan PDX exakt rekapitulera de histopatologiska kännetecken mänsklig astrocytom, including invasion, orthotopic xenografter av etablerade humana cellinjer i allmänhet inte 21,23,25. Dessutom normala mänskliga astrocyter och NSC har genetiskt engineered med definierade onkogena mutationer att modellera astrocytom tumörigenes in vitro och in vivo 13,14,26. Dessa celler saknar den genomiska komplexiteten av etablerade humana cellinjer och PDX och noggrant rekapitulera humant astrocytom histopatologi, men kräver xenografting i immundefekta gnagare in vivo. Eftersom alla humana cellmodeller kräver immunodeficienta gnagare värdar för att förhindra immunmedierad xenograftavstötning, dessa modeller inte rekapitulera de infödda tumör-stroma interaktioner av ett syngent systemet och saknar ett intakt immunsystem, vilket begränsar preklinisk undersökning av stroma inriktade och immunmodulerande terapier 10,11.

GEM tillåter granskning av de fenotypiska konsekvenserna av förutbestämda kombinationer av onkogen mutationer in vivo under in situ tumorigenes. Icke-villkorlig GEM har mutationer i alla vävnader i hela utveckling, har villkorat GEM floxed onkogena alleler som möjliggör inriktning av mutationer genom att begränsa Cre-medierad rekombination till specifika celltyper genom att använda cell typspecifika promotorer 10,11,15,18. Villkorlig astrocytom GEM har använts för att belysa de funktionella roller onkogena mutationer i olika celltyper inom en intakt hjärna 11. Den prekliniska användbarheten av in situ gliomagenesis använder villkorad GEM är begränsad av ett antal faktorer, inklusive en) avsaknaden av en in vitro-korrelat, 2) svårigheten att generera stora kohorter av möss med komplexa genotyper, 3) lång latens på in situ-tumörutveckling , 4) och stokastisk tumörprogression. För i situ tumorigenes saknar en motsvarande in vitro-modell, inte kan utföras drogtestning in vitro wITH konventionella villkor GEM modeller. I motsats till andra typer av cancer, är villkorade GEM modeller av astrocytom sällan inducerad av enkel onkogena mutationer 11. Således är komplexa avelsprogram krävs för att generera villkor GEM med flera onkogena mutationer. Dessutom sker astrocytom initiering med variabel penetrans efter en lång latensperiod i dessa modeller, medan progression till höggradig astrocytom uppträder i allmänhet i en icke-enhetlig, stokastisk sätt och i slutändan ger upphov till tumörer med komplexa genomiska landskap och snabb tillväxt kinetik 27, 28. Den rörliga penetrans och stokastiska natur malign progression i villkor GEM modeller kräver att enskilda möss screenas genom radiografisk avbildning för att påvisa förekomst och lokalisering av hög kvalitet astrocytom innan de är inregistrerade i prekliniska läkemedelsprövningar. Sammantaget ger dessa begränsningar hindrar produktion och testning av de stora kohorter av villkor GEM krävs för preclinical drogtestning.

Den RCAS-TVA GEM-systemet, som utnyttjar avian retrovirala (RCAS) vektorer för att infektera GEM konstruerad för att uttrycka den virala receptorn (TVA) på specifika neuronala celltyper, har i stor utsträckning används för att modellera astrocytom tumorigenes 11. I motsats till villkorlig GEM möjliggör detta modellsystem införa multipla onkogena mutationer i specifika celltyper utan krav på komplexa avelsprogram. Det är dock begränsad av variabel penetrans, kravet på att aktivt delande celler för att uppnå viral integration och den slumpmässiga införande av transgener i värdgenomet 29.

Icke nedärvda GEM (nGEM) modeller, som använder celler som skördats från GEM, blir allt viktigare eftersom de övervinna många av de begränsningar av andra modellsystem 15. Den roll som initiativ celltyp och samarbete förekommer mutationer i astrocytom patogenes är svåra att avskräckagruvan med hjälp av etablerade humana GBM cellinjer eller PDX eftersom de kommer från slutstegs tumörer som har ackumulerats omfattande genetiska mutationer i odefinierade celltyper under malign progression. Däremot kan alla kvaliteter av astrocytom modelleras med hjälp nGEM genom att inducera definierad genetiska mutationer i specifika renade hjärnan celltyper 11,30. Således kan påverkan av specifika genetiska mutationer och celltyp om cellulära och molekylära fenotyper bestämmas in vitro och in vivo. Liknar etablerade humana GBM cellinjer, kan initialt in vitro drogtestning med hjälp nGEM användas för att prioritera läkemedel för in vivo-testning som använder samma celler. Tumorigenesis in vivo kan sedan bestämmas genom allografting nGEM celler ortotopiskt in i hjärnorna på immunkompetenta syngeniska kullsyskon 30. Dessa orthotopic transplantationsmodeller tillåter därmed in vivo-testning inte bara av konventionella cytotoxiska and inriktade terapier, men immunmodulerande och stroma inriktade terapier också. Slutligen kan den roll som mikromiljön på tumör initiering och progression bestämmas genom att jämföra resultaten mellan nGEM och konventionella GEM modeller med användning av samma mutationer i samma celltyper.

Vi och andra har utvecklat astrocytom nGEM använder primära celler – astrocyter, NSC, eller oligodendrocyt prekursorceller (OPC) – skördas från GEM 30-34. Logiken bakom utvecklingen av en astrocytom nGEM var att skapa en modell för att bestämma de fenotypiska konsekvenserna av onkogena mutationer i specifika celltyper som potentiellt skulle kunna användas för preklinisk drogtester in vitro och in vivo i immunkompetenta djur. Vi skördade fenotypiskt WT kortikala astrocyter och NSC från icke-Cre uttrycker, villkor GEM upprätthålls på en> 94% C57 / BL6 bakgrund med floxed RB vägen – Rb1 loxP / loxP eller TgGZT121 – och floxed RTK / RAS / PI3K vägen – NF1 loxP / loxP, Kras G12D, PTEN loxP / loxP – gener i olika kombinationer 35-39. Vi framkallade genetisk rekombination in vitro med användning av adenovirusvektorer kodar Crerekombinas. Eftersom kortikala astrocyternas skördar innehåller en blandning av celltyper, använde vi Ad5GFAPCre vektorer eller dominerande onkogena transgener, såsom TgGZT 121 drivs från den mänskliga GFAP promotor, att anrika GFAP + kortikala astrocyter i dessa kulturer. Vi definierade de fenotypiska konsekvenserna av G 1 / S (Rb), MAPK, och PI3K pathway mutationer i kortikala astrocyter och NSC in vitro och in vivo. MAPK och PI3K vägen aktiverad G1 / S-defekta astrocyter molekylärt härmade mänskliga proneural GBM och vid orthotopic injektion, bildade tumörer i en fördefinierad plats med enhetliga tillväxt kinetik, korta latenser och histopatologiskaal kännetecken human GBM 30. Längsgående övervakning av tumörtillväxt in vivo hjälpmedel prekliniska drogtestning genom normalisering av behandlings kohorter och kvantitativ analys av tumörtillväxt som svar på behandling 40. Vi bestämde tumörtillväxt kinetik med längd mareld avbildning av möss som injicerats med luciferas uttrycker kortikala astrocyter. Därför kortikala astrocyter och NSC härrör från villkor GEM ger en lätthanterlig modellsystem för definition av funktionella konsekvenserna av astrocytom associerade mutationer och en potentiell systemmodell för preklinisk läkemedelsutveckling.

Protocol

Samtliga djurstudier godkändes av University of North Carolina Institutional Animal Care och användning kommittén. 1 Odling Kortikal Astrocyter från Neonatal Möss Framställning Crumple 2-3 grannlaga uppgift vävnader och placera in i botten av en kolv innehållande 70% etanol. Placera dissekera sax, böjda pincett och 2 par raka mikro pincett i denna kolv. Vävnaderna används för att undvika böjning mikro pincett. Tillsätt 1 ml HBSS till en 60 mm vävn…

Representative Results

Vi utvecklade ett nGEM modellsystem med kortikala astrocyter och NSC skördas från neonatal GEM hyser floxed villkor onkogena alleler som kan fenotypiskt kännetecknas in vitro och in vivo (Figur 1). För att undersöka konsekvenserna av onkogena mutationer specifikt i kortikala astrocyter in vitro, är det viktigt att först anrika astrocyter. Kortikala astrocyternas skördar innehålla en blandning av mikroglia, astrocyter, oligodendrocyter OPC och nervceller, men mekaniska…

Discussion

De mest kritiska stegen för att säkerställa korrekt skörd och odling av kortikala astrocyter är 1) för att skära ut kortex utan att ta vävnad nedan corpus callosum, 2) för att avlägsna hjärnhinnorna, 3) att grundligt dissociera cellerna, och 4) för att anrika för GFAP + astrocyter. Även om vi använde mekanisk (skakningar) och genetisk (begränsning av genetisk rekombination med en Ad5GFAPCre vektor eller utnyttjande av en dominerande trans transgen (TgGZT 121) under GFAP…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

CRM is a Damon Runyon-Genentech Clinical Investigator. This work was supported, in part, by grants to CRM from the Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), Department of Defense (W81XWH-09-2-0042), and University of North Carolina University Cancer Research Fund (UCRF). The authors wish to thank Daniel Roth for mouse husbandry assistance. The authors also wish to thank Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette, and Susannah Krom for tissue culture and immunofluorescence assistance.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Invitrogen 11995065 DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro
Fetal Bovine Serum, Regular Cellgro 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-395
Cartilage Thumb Forceps, Curved Fisher Scientific 1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 Miltex 17-301
Ethanol (200 proof) Decon Labs 2710
Razor Blades VWR 55411-050
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid Invitrogen 14175-095
TrypLE Express (1X), Phenol Red Invitrogen 12605-010 Other Trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture
CULTURE DISH, 60 x 15 mm Thomas Scientific 9380H77
15 ml tubes BD Biosciences 352096
50 ml tubes BD Biosciences 352070
Adenovirus stock Gene Transfer Vector Core, U. Iowa Ad5CMVCre Store in 5 µl aliquots at -80 C. Hazardous.  Use Bsl2 safetyy  precautions
Sodium sulfate (Na2SO4)  Sigma-Aldrich 238597
Potassium sulfate (K2SO4) Sigma-Aldrich 221325
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich 746495
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
D-(+)- Glucose Sigma-Aldrich G8270 
Phenol Red Sigma-Aldrich P3532
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881
Papain Worthington LS003127
L-Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C1276
Syringe filter (0.22 µm pore size) Millipore SLGP033NS
Neurocult proliferation kit, mouse Stemcell Technologies 5702 This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture
0.2% Heparin solution Stemcell Technologies 7980
EGF  Invitrogen PMG8041
bFGF  Invitrogen PHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) Invitrogen 14185-052
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
E-64 Sigma-Aldrich E3132 Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Cell strainer (40 µm pore size) Corning 352340
Stem cell dissociation solution Stemcell Technologies 5707 Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase
Methyl cellulose 15 cP Sigma-Aldrich M7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2X Millipore SLM-202-B For making 5% methyl cellulose solution
1.7mL Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning 3620
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle Fisher Scientific 14-815-92
PB600-1 Antigen Dispenser Hamilton  83700
Disposable 18 ga needles  Fisher Scientific NC9015638 
27 ga 1/2" luer tip needle Fisher Scientific 14-826-48
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-Aldrich T48402
Betadine Fisher Scientific NC9386574
Puralube Opthalmic Ointment Fisher Scientific NC9689910
 Model 900 Stereotaxic frame Kopf Instruments
VETBOND Fisher Scientific NC9259532  Tissue adhesive 
Lidocaine  ShopMedVet RXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3580
Anti-Sox2 Millipore AB5603
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako Z0334 
IVIS Kinetic PerkinElmer For in vivo imaging
D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate PerkinElmer 122796 For in vivo bioluminescence imaging
EdU Imaging Kit Invitrogen C10340
MSCV Luciferase PGK-hygro Addgene 18782
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, 1-49 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal Of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Giese, A., Bjerkvig, R., Berens, M. E., Westphal, M. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment. J. Clin. Oncol. 21 (8), 1624-1636 (2003).
  4. Miller, C. R., Perry, A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab. Med. 131 (3), 397-406 (2007).
  5. . Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  8. Phillips, H. S., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9 (3), 157-173 (2006).
  9. Vitucci, M., Hayes, D. N., Miller, C. R. Gene expression profiling of gliomas: merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br. J. Cancer. 104 (4), 545-553 (2011).
  10. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  11. Schmid, R. S., Vitucci, M., Miller, C. R. Genetically engineered mouse models of diffuse gliomas. Brain Res. Bull. 88 (1), 72-79 (2012).
  12. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  13. Sonoda, Y., et al. Formation of intracranial tumors by genetically modified human astrocytes defines four pathways critical in the development of human anaplastic astrocytoma. Cancer Res. 61 (13), 4956-4960 (2001).
  14. Mao, X. G., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes glioblastoma tumorigenesis through a pro-invasive genetic program. Oncotarget. 4 (7), 1050-1064 (2013).
  15. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat. Rev. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
  16. Miller, C. R., Williams, C. R., Buchsbaum, D. J., Gillespie, G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. Cancer Res. 62 (3), 773-780 (2002).
  17. Becher, O. J., Holland, E. C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 66 (7), 3355-3358 (2006).
  18. Huse, J. T., Holland, E. C. Genetically engineered mouse models of brain cancer and the promise of preclinical testing. Brain Pathol. 19 (1), 132-143 (2009).
  19. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  20. Li, A., et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas. Mol. Cancer Res. 6 (1), 21-30 (2008).
  21. Vries, N. A., Beijnen, J. H., van Tellingen, O. High-grade glioma mouse models and their applicability for preclinical testing. Cancer Treat. Rev. 35 (8), 714-723 (2009).
  22. Clark, M. J., et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 6 (1), (2010).
  23. Carvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28 (2), 181-190 (2010).
  24. Yost, S. E., et al. High-resolution mutational profiling suggests the genetic validity of glioblastoma patient-derived pre-clinical models. PLoS One. 8 (2), (2013).
  25. Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 7 (2), 164-176 (2005).
  26. Rich, J. N., Guo, C., McLendon, R. E., Bigner, D. D., Wang, X. F., Counter, C. M. A genetically tractable model of human glioma formation. Cancer Res. 61 (9), 3556-3560 (2001).
  27. Chow, L. M., et al. Cooperativity within and among Pten, p53, and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain. Cancer Cell. 19 (3), 305-316 (2011).
  28. Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
  29. Werder, A., Seidler, B., Schmid, R. M., Schneider, G., Saur, D. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system. Nat. Protoc. 7 (6), 1167-1183 (2012).
  30. Vitucci, M., et al. Cooperativity between MAPK and PI3K signaling activation is required for glioblastoma pathogenesis. Neuro Oncol. 15 (10), 1317-1329 (2013).
  31. Yahanda, A. M., Bruner, J. M., Donehower, L. A., Morrison, R. S. Astrocytes derived from p53-deficient mice provide a multistep in vitro model for development of malignant gliomas. Mol. Cell. Biol. 15 (8), 4249-4259 (1995).
  32. McEllin, B., et al. PTEN loss compromises homologous recombination repair in astrocytes: implications for glioblastoma therapy with temozolomide or poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Cancer Res. 70 (13), 5457-5464 (2010).
  33. Kim, H. S., et al. Gliomagenesis arising from Pten- and Ink4a/Arf-deficient neural progenitor cells is mediated by the p53-Fbxw7/Cdc4 pathway, which controls c-Myc. Cancer Res. 72 (22), 6065-6075 (2012).
  34. Radke, J., Bortolussi, G., Pagenstecher, A. Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice. PLoS One. 8 (2), (2013).
  35. Marino, S., Vooijs, M., Der Gulden, H. v. a. n., Jonkers, J., Berns, A. Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum. Genes Dev. 14 (8), 994-1004 (2000).
  36. Zhu, Y., et al. Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev. 15 (7), 859-876 (2001).
  37. Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
  38. Xiao, A., Wu, H., Pandolfi, P. P., Louis, D. N., Van Dyke, T. Astrocyte inactivation of the pRb pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation. Cancer Cell. 1 (2), 157-168 (2002).
  39. Xiao, A., Yin, C., Yang, C., Di Cristofano, A., Pandolfi, P. P., Van Dyke, T. Somatic induction of Pten loss in a preclinical astrocytoma model reveals major roles in disease progression and avenues for target discovery and validation. Cancer Res. 65 (12), 5172-5180 (2005).
  40. Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J. Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
  41. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  42. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  43. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J. Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
  44. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  45. Miller, C. R., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K. A genetically-defined, orthotopic allograft model system of glioblastoma: Pathological features and experimental therapeutics. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69 (5), 522 (2011).
  46. Bash, R., et al. Concurrent temozolomide-external beam radiation therapy is effective for experimental glioblastomas in an orthotopic, genetically engineered syngeneic mouse allograft model system. Neuro Oncol. 11 (5), 638 (2009).
  47. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J. Neurosci. Meth. 150 (1), 128-137 (2006).
  48. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  49. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  50. Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
  51. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685-705 (2013).
  52. Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
  53. Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat. Rev. Neurosci. 12 (2), 88-104 (2011).
  54. Burrell, K., Agnihotri, S., Leung, M., Dacosta, R., Hill, R., Zadeh, G. A novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics. J. Vis Exp. e50363 (76), (2013).
  55. Sottoriva, A., et al. Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4009-4014 (2013).
  56. Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer Cell. 20 (6), 810-817 (2011).

Tags

Keywords: AstrocytomaGlioblastomaCortical AstrocytesNeural Stem CellsConditional Genetically Engineered MiceOncogenic MutationsTumor Suppressor GenesIn Vitro TransformationOrthotopic AllograftsBioluminescence ImagingPreclinical Drug Development
check_url/it/51763?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K., Werneke, A. M., Constance, B. H., Huff, B., Miller, C. R. Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice. J. Vis. Exp. (90), e51763, doi:10.3791/51763 (2014).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image