الزنك الاصبع نوكلياز المحسن استهداف الجينات في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية
Summary
خطوط الخلايا مراسل توفر وسيلة لتصور، وتتبع وعزل الخلايا من الاهتمام من السكان غير متجانسة. ومع ذلك، باستخدام إعادة التركيب مثلي التقليدية في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية استهداف الجين غير فعال للغاية. هنا، نحن تصف استهداف CNS محدد المخ الأوسط عامل النسخ PITX3 موضع مع EGFP باستخدام إصبع الزنك نوكلياز تعزيز إعادة التركيب مثلي.
Abstract
واحد القيود الرئيسية مع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ESC) بروتوكولات التمايز الحالية هو الجيل من السكان الخلية غير المتجانسة. هذه الثقافات تحتوي على خلايا الفائدة، ولكن الملوثة أيضا مع المجالس الاقتصادية والاجتماعية غير متمايزة، والمشتقات غير العصبية والخلايا العصبية فرعية أخرى. هذا يحد من استخدامها في في المختبر وفي الجسم الحي التطبيقات، مثل النمذجة في المختبر لاكتشاف الأدوية أو العلاج ببدائل الخلية. للمساعدة في التغلب على هذا، خطوط الخلايا مراسل، والتي تقدم وسيلة لتصور وتتبع وعزل الخلايا من الفائدة، يمكن هندستها. ومع ذلك، من أجل تحقيق هذا في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية عبر إعادة التركيب مثلي التقليدية غير فعالة للغاية. هذا البروتوكول يصف استهداف homeobox النخامية 3 (PITX3) موضع في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية باستخدام مصمم خصيصا nucleases إصبع الزنك، الذي يعرض فواصل الحمض النووي المزدوج حبلا في مواقع محددة، جنبا إلى جنب معPITX3 – EGFP -specific ناقلات المانحة DNA. بعد جيل من خط الخلية مراسل PITX3، فإنه يمكن عندئذ أن تكون متباينة باستخدام بروتوكولات نشرت للاستخدام في الدراسات مثل النمذجة المرض في المختبر أو استبدال خلية العلاج باركنسون.
Introduction
الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) بروتوكولات التمايز الحالية تؤدي إلى السكان الخلية غير متجانسة، ولا سيما فيما يتعلق اشتقاق الظواهر العصبية محددة. وهكذا، على الرغم من الثقافات تحتوي على النمط الظاهري الخلوية المطلوب، العصبية الأخرى، وأنواع الخلايا غير العصبية وغير متمايزة، غالبا ما تكون موجودة 1. هذه الخصائص تحد من تطبيق ESC مصادر اشتقاق الخلايا لاستخدامها في العلاج ببدائل الخلية والنمذجة المرض في المختبر.
خطوط الخلايا مراسل الوراثية توفر وسيلة لتصور، وتتبع وعزل الخلايا من الفائدة، شريطة أن يكون التعبير عن بروتين مراسل (RP) يستنسخ التعبير الذاتية. استخدام المروجين المنبع مباشرة من منطقة الجين الترميز يمكن استخدامها لاستخلاص صحفيين الجيني الخام ولكن مثل هذه البنى التنظيمية تفتقر إلى العناصر الدقيقة التي تتحكم في التعبير الجيني الذاتية. في المقابل، إعادة التركيب مثلي يقدمفرصة لضمان عالية الدقة تعبير عن RP. في الماضي، واستهداف ناقلات مصممة لإعادة التركيب مثلي في مواضع محددة من الفائدة التي استخدمت لاستهداف RPS في الماوس المجالس الاقتصادية والاجتماعية (mESCs) باستخدام Electroporation للكوسيلة لتسليم DNA 1،2. ومع ذلك الجيل من خطوط الخلايا مراسل عبر إعادة التركيب مثلي التقليدية غير فعالة للغاية بالنسبة المجالس الاقتصادية والاجتماعية البشرية (hESCs)، وبالتالي قد تم توثيقه فقط في عدد قليل من الحالات (التي تم استعراضها في 3). باستخدام بروتين خيالية المهندسة تحتوي على الانصهار من فوك أنا نوكلياز بزخارف الزنك الاصبع في مواقع محددة، والمعروفة ب الزنك إصبع nucleases (ZFNs)، DNA فواصل المزدوج حبلا يمكن إدخالها في مواضع محدد مسبقا الجيني. عند إضافة ناقلات DNA مع التماثل لكلا الجانبين من الحمض النووي حبلا كسر مزدوج، يمكن اصلاحها الموقع الجيني عن طريق إعادة التركيب مثلي، والسماح للإدراج تسلسل الحمض النووي المانحة. وقد أثبتت هذه التقنية و مفيدةأو تحرير الجيني في كل من الخلايا الأولية الإنسان وhESCs 4،5 6،7. أكثر الأعمال الأخيرة وقد استخدمت النسخ الشبيهة المنشط nucleases المستجيب (TALENs)، عوامل النسخ التي تستخدمها مسببات الأمراض النباتية 8، للمساعدة في تصميم nucleases موقع معين 9.
في البروتوكول التالية نظهر الجيل خط خلية مراسل HESC بواسطة Electroporation للمن EGFP تحتوي على استهداف ناقلات مثلي 6 مع ZFNs لhomeobox النخامية البشري 3 (PITX3) موضع. بعد اختيار المضادات الحيوية لمدة 2-3 أسابيع، hESCs مع الحمض النووي متكاملة بشكل صحيح يمكن التقاطها يدويا، وتوسعت في البداية عن طريق فحص PCR، والتحقق من صحتها فيما بعد النشاف الجنوبي.
Protocol
Representative Results
Discussion
جيل من خطوط الخلايا مراسل يوفر وسيلة قوية لتتبع وتصور وعزل خلايا الفائدة من السكان غير متجانسة المستمدة من hESCs. ومع ذلك، فقد أثبتت استهداف الجينات عبر إعادة التركيب مثلي التقليدية لتكون فعالة للغاية بالنسبة المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان 3. في هذا البر…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقدم العمل المبين في هذا البروتوكول بفضل تمويل من حكومة فيكتوريا كجزء من تحالف التعاوني مع معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM).
Materials
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer – 40um | BD Biosciences | 352340 | |
| 33mm – 0.22 um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
Riferimenti
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
- Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential. Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).
- Collin, J., Lako, M. Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells. Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).
- Carroll, D. Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents. Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).
- Boch, J., Bonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).
- Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).
- Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).
- Smidt, M. P., et al. A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).
