Zink-finger Nuclease Forbedret genmålretning i humane embryonale stamceller
Summary
Reporter cellelinjer tilbyder et middel til at visualisere, spore og isolere celler af interesse fra heterogene populationer. Men gen-targeting anvendelse af konventionel homolog rekombination i humane embryonale stamceller er yderst ineffektivt. Heri beskriver vi målrettet CNS midthjernen specifik transkriptionsfaktor PITX3 locus med EGFP hjælp zink-finger nuklease forbedret homolog rekombination.
Abstract
En væsentlig begrænsning med aktuelle humane embryonale stamceller (ESC) differentiering protokoller er dannelsen af heterogene cellepopulationer. Disse kulturer indeholder cellerne af interesse, men er også forurenet med udifferentierede økonomiske og sociale råd, ikke-neurale derivater og andre neuronale undertyper. Dette begrænser deres anvendelse i in vitro og in vivo applikationer, såsom in vitro-modellering for lægemiddelforskning eller udskiftning celleterapi. For at hjælpe med at overvinde dette, reporter cellelinjer, som tilbyder et middel til at visualisere, spore og isolere celler af interesse, kan manipuleres. Men for at opnå dette i humane embryonale stamceller via konventionel homolog rekombination er meget ineffektiv. Denne protokol beskriver målretning af hypofysen homeobox 3 (PITX3) locus i humane embryonale stamceller ved hjælp af specialdesignede zink-finger nukleaser, som introducerer stedspecifikke dobbeltstrenget DNA pauser, sammen med enPITX3 – EGFP-specifikke DNA-donor vektor. Efter genereringen af PITX3 reporter cellelinie, kan det derefter være differentieret anvendelse af offentliggjorte protokoller til anvendelse i undersøgelser som in vitro Parkinsons sygdom modellering eller celleerstatningsterapi.
Introduction
Aktuelle embryonale stamceller (ESC) differentiering protokoller resulterer i heterogene cellepopulationer, især med hensyn til afledning af specifikke neuronale fænotyper. Selv om kulturer indeholder den ønskede cellefænotypen andre neuronale, ikke-neuronal og un-opdelte celletyper er ofte til stede 1. Disse egenskaber begrænser anvendelsen af ESC afledte cellekilder til brug i celleerstatningsterapi og in vitro sygdomsmodeller.
Genetiske reporter cellelinjer giver et middel til at visualisere, spore og isolere celler af interesse, forudsat at ekspressionen af reporter protein (RP) gengiver endogen ekspression. Anvendelse af promotorer umiddelbart opstrøms for et gen kodende område kan anvendes til at udlede rå genetiske reportere, men sådanne konstruktioner mangler de præcise regulatoriske elementer, der styrer endogen genekspression. I modsætning hertil tilbyder homolog rekombinationmulighed for at sikre high-fidelity udtryk for RP. Tidligere har rettet i vektorer designet til homolog rekombination specifik loci af interesse er blevet anvendt til at målrette RP'er i mus ESC (mESCs) ved hjælp af elektroporation som et middel til DNA-levering 1,2. Men dannelsen af reporter cellelinjer via konventionel homolog rekombination er ekstremt ineffektiv for menneskerettighederne økonomiske og sociale råd (hESCs), og dermed er kun blevet dokumenteret i en håndfuld sager (revideret i 3). Ved at bruge et manipuleret kimære protein, der indeholder en fusion af en Fokl nuklease med stedspecifikke zink-finger motiver, kendt kollektivt som zink-finger nukleaser (ZFNs), kan indføres DNA dobbelt-strenget pauser på forudbestemte genomisk loci. Når der tilsættes en DNA-vektor med homologi til begge sider af DNA-dobbeltstreng pause, kan det genomiske sted repareres ved homolog rekombination, således at inkorporering af den DNA-donor sekvensen. Denne teknik har vist sig nyttig feller genomisk redigering i både humane primære celler 4,5 og hESCs 6,7. Nyere arbejde har udnyttet transskription aktivator-lignende effektor nukleaser (Talens), transkriptionsfaktorer bruges af plantepatogener 8, for at hjælpe med udformningen af stedspecifikke nukleaser 9.
I det følgende protokol demonstrere vi frembringelsen af et embryonale reporter cellelinie ved elektroporering af en EGFP indeholdende homolog målretning vektor 6 sammen med ZFNs for menneskelige hypofyse homeobox 3 (PITX3) locus. Efter antibiotisk selektion i 2-3 uger, kan hESCs med korrekt integreret DNA manuelt plukkes, ekspanderet og indledningsvist screenet via PCR og efterfølgende godkendt af Southern blotting.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dannelsen af reporter cellelinjer giver et stærkt middel til at spore, visualisere og isolere celler af interesse fra en heterogen population afledt fra hESCs. Imidlertid har genmålretning via konventionel homolog rekombination vist sig at være særdeles ineffektiv for menneskerettighederne økonomiske og sociale råd 3. I denne protokol beskriver vi en forholdsvis simpel teknik til at indføre en RP i exon en af PITX3 locus i hESCs med en gængs målvektor sammen med ZFNs. I vores hænder g…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet er beskrevet i denne protokol blev muliggjort af støtte fra den victorianske regering som en del af et samarbejde alliance med den californiske Institut for regenerativ medicin (CIRM).
Materials
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer – 40um | BD Biosciences | 352340 | |
| 33mm – 0.22 um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
Riferimenti
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
- Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential. Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).
- Collin, J., Lako, M. Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells. Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).
- Carroll, D. Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents. Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).
- Boch, J., Bonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).
- Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).
- Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).
- Smidt, M. P., et al. A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).
