Zink-vinger Nuclease Enhanced gentargeting in menselijke embryonale stamcellen
Summary
Reporter cellijnen bieden een middel om te visualiseren, te volgen en te isoleren cellen van belang zijn van de heterogene populatie. Echter, gen targeting met gebruikelijke homologe recombinatie in humane embryonale stamcellen is inefficiënt. Hierin beschrijven we richten CNS middenhersenen specifieke transcriptiefactor PITX3 locus met EGFP met zink-vinger nuclease verbeterde homologe recombinatie.
Abstract
Een belangrijke beperking van de huidige menselijke embryonale stamcellen (ESC) differentiatie protocollen is de generatie van heterogene celpopulaties. Deze kweken bevatten de cellen van belang, maar ook verontreinigd met ongedifferentieerde SER, niet-neurale derivaten en andere neuronale subtypes. Dit beperkt hun gebruik in in vitro en in vivo toepassingen, zoals in vitro model voor geneesmiddelenonderzoek of celvervangingstherapie. Om u te helpen overwinnen van deze, reporter cellijnen, die een middel om te visualiseren, te volgen en te isoleren cellen van belang te bieden, kunnen worden geconstrueerd. Echter, om dit te bereiken in humane embryonale stamcellen via conventionele homologe recombinatie inefficiënt. Dit protocol beschrijft richten van de hypofyse homeobox 3 (PITX3) locus in humane embryonale stamcellen met aangepaste gemaakt zinkvinger nucleasen die plaats-specifieke dubbelstrengs DNA breuken te introduceren, samen met eenPITX3 – EGFP-specifieke DNA donorvector. Na het genereren van de PITX3 reporter cellijn kan dan worden gedifferentieerd door gepubliceerde protocollen voor gebruik in studies zoals in vitro Parkinson ziektemodel of celvervangingstherapie.
Introduction
Voor deze embryonale stamcel (ESC) differentiatie protocollen resulteren in heterogene celpopulaties, met name wat betreft de afleiding van specifieke neuronale fenotypen. Ofschoon kweken bevatten de gewenste cellulaire fenotype, andere neuronale en niet-neuronale en niet-gedifferentieerde celtypen zijn vaak aanwezig 1. Deze eigenschappen beperken de toepassing van ESC afgeleid cel bronnen voor gebruik in celvervangingstherapie en in vitro ziektemodel.
Genetische reporter cellijnen bieden een middel te visualiseren, te volgen en te isoleren cellen van belang, op voorwaarde dat de expressie van het eiwit (RP) reproduceert endogene expressie. Het gebruik van promoters onmiddellijk stroomopwaarts van een gen coderend gebied kan worden gebruikt om ruwe genetische reporters ontlenen maar dergelijke constructen missen de juiste regulerende elementen dat endogene genexpressie. Daarentegen homologe recombinatie biedtmogelijkheid om high-fidelity uitdrukking van de RP te garanderen. In het verleden, richtende vectoren ontworpen voor homologe recombinatie op specifieke loci plaats zijn gebruikt om RP in muizen SER (mESCs) te zoeken via elektroporatie als middel DNA levering 1,2. De generatie van de reporter cellijnen via conventionele homologe recombinatie is echter zeer inefficiënt voor menselijke SER (hESC 's), en dus alleen onderbouwd in een handvol gevallen (beoordeeld in 3). Door een gemanipuleerde chimere eiwit dat een fusie van een Fok I nuclease met plaatsspecifieke zinkvinger motieven, gezamenlijk bekend als zinkvinger nucleasen (ZFNs), DNA dubbelstrengs breuken op vooraf bepaalde genomische loci worden geïntroduceerd. Wanneer een DNA vector met homologie aan beide zijden van de DNA dubbele streng breuk wordt toegevoegd, kan de genomische locatie worden gerepareerd door homologe recombinatie, waardoor de opname van de DNA-sequentie donor. Deze techniek is nuttig gebleken fof genomische bewerken in zowel humane primaire cellen 4,5 en hESCs 6,7. Meer recent werk is gebruikt transcriptie activator-achtige effector nucleases (Talens), transcriptiefactoren gebruikt door plantenpathogenen 8, om te helpen bij het ontwerp van de site-specifieke nucleasen 9.
In het volgende protocol tonen we de vorming van een hESC reporter cellijn door elektroporatie van een EGFP die homoloog targeting vector 6 met ZFNs voor de menselijke hypofyse homeobox 3 (PITX3) locus. Na antibiotische selectie voor 2-3 weken, kan hESCs met correct geïntegreerde DNA handmatig worden geplukt, uitgebreid en gescreend in eerste instantie via PCR, en vervolgens gevalideerd door Southern blotting.
Protocol
Representative Results
Discussion
De generatie van de reporter cellijnen biedt een krachtig middel op te sporen, te visualiseren en te isoleren cellen van belang uit een heterogene populatie afkomstig van hESC '. Echter, gene targeting via conventionele homologe recombinatie heeft bewezen zeer inefficiënt voor menselijke SER 3 zijn. In dit protocol beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige techniek voor het inbrengen van een RP in exon een van de PITX3 locus, in hESCs behulp van een algemeen gebruikt richtende vector met ZFNs. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Werk beschreven in dit protocol werd mede mogelijk gemaakt door financiering uit het Victoriaanse regering als onderdeel van een samenwerkingsproject alliantie met het Californische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde (CIRM).
Materials
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer – 40um | BD Biosciences | 352340 | |
| 33mm – 0.22 um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
Riferimenti
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
- Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential. Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).
- Collin, J., Lako, M. Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells. Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).
- Carroll, D. Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents. Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).
- Boch, J., Bonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).
- Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).
- Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).
- Smidt, M. P., et al. A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).
