Doigt de zinc nucléase Gene meilleur ciblage dans embryonnaires humaines Cellules souches
Summary
des lignées cellulaires rapporteurs offrent un moyen de visualiser, de suivre et d'isoler des cellules d'intérêt à partir de populations hétérogènes. Cependant, le ciblage génique en utilisant une recombinaison homologue conventionnelle dans les cellules souches embryonnaires humaines est extrêmement inefficace. Ici, nous décrivons le ciblage CNS lieu mésencéphale spécifique Pitx3 facteur de transcription avec EGFP en utilisant doigt de zinc nucléase amélioré recombinaison homologue.
Abstract
Une limitation majeure avec les protocoles de différenciation actuels cellules souches embryonnaires humaines (ESC) est la génération de populations cellulaires hétérogènes. Ces cultures contiennent les cellules d'intérêt, mais sont également contaminés avec les CES indifférenciées, les dérivés non-neural et d'autres sous-types de neurones. Ceci limite leur utilisation in vitro et in vivo dans des applications telles que la modélisation in vitro pour la découverte de médicaments ou la thérapie de remplacement cellulaire. Pour aider à surmonter cela, des lignées de cellules rapporteurs, qui offrent un moyen de visualiser, suivre et isoler les cellules d'intérêt, peuvent être conçus. Cependant, pour atteindre cet objectif dans des cellules souches embryonnaires humaines, par recombinaison homologue conventionnelle est extrêmement inefficace. Ce protocole décrit le ciblage de la homéobox pituitaire 3 (Pitx3) locus dans les cellules souches embryonnaires humaines en utilisant des nucléases zinc des doigts conçus sur mesure, qui introduisent double-brin de cassures de l'ADN spécifique au site, avec unePitx3 – vecteur donneur d'ADN spécifique de EGFP. Suite à la génération de la lignée cellulaire rapporteur Pitx3, il peut alors être différencié en utilisant des protocoles publiés pour une utilisation dans des études in vitro telles que la modélisation de la maladie ou la thérapie de remplacement cellulaire dans la maladie de Parkinson.
Introduction
Les cellules souches embryonnaires (ESC) de différenciation des protocoles actuels conduisent à des populations de cellules hétérogènes, en particulier en ce qui concerne la dérivation de phénotypes neuronaux spécifiques. Ainsi, bien que les cultures contiennent le phénotype cellulaire souhaité, d'autres neurones, les types de cellules non-neuronales et non différenciées sont souvent présents 1. Ces caractéristiques limitent l'application de l'ESC dérivée de sources cellulaires pour une utilisation dans la thérapie de remplacement cellulaire et la modélisation de la maladie in vitro.
Des lignées cellulaires rapporteurs génétiques offrent un moyen de visualiser, de suivre et d'isoler des cellules d'intérêt, à la condition que l'expression de la protéine rapporteur (RP) reproduit expression endogène. L'utilisation de promoteurs immédiatement en amont d'une région codante du gène peut être utilisé pour dériver reporters génétiques brut mais ces constructions n'ont pas les éléments de régulation qui contrôlent précisément l'expression du gène endogène. En revanche, la recombinaison homologue proposepossibilité d'assurer l'expression de haute fidélité de la RP. Dans le passé, des vecteurs de ciblage conçus pour la recombinaison homologue au locus spécifique d'intérêt ont été utilisés pour cibler PR chez la souris (CES mESCs) par électroporation comme un moyen de délivrance d'ADN 1,2. Cependant, la génération de lignées cellulaires rapporteurs par recombinaison homologue conventionnelle est extrêmement inefficace pour CES humaines (CSEh), et par conséquent n'a été documentée dans un petit nombre de cas (revue dans 3). En utilisant une protéine chimérique conçu contenant une fusion d'une nucléase Fok I avec des motifs en doigt de zinc spécifiques au site, connus collectivement sous le doigt de zinc (ZFN nucléases), cassures de l'ADN double-brin peuvent être introduits à des loci génomiques pré-déterminé. Quand un vecteur d'ADN ayant une homologie avec les deux côtés de la cassure double brin d'ADN est ajouté, le site génomique peut être réparé par une recombinaison homologue, ce qui permet l'incorporation de la séquence d'ADN du donneur. Cette technique s'est avérée utile fou l'édition génomique dans les cellules humaines primaires 4,5 et 6,7 CSEh. Plus des travaux récents ont utilisés transcription activateur comme effecteurs nucléases (Talens), des facteurs de transcription utilisés par les agents phytopathogènes 8, pour aider à la conception des nucléases spécifiques au site 9.
Dans le protocole suivant, nous démontrons la génération d'une lignée de cellules hESC rapporteur par électroporation d'un vecteur contenant l'EGFP de ciblage homologue 6, conjointement avec la ZFN pour homéoboîte de l'hypophyse humaine 3 (Pitx3) locus. Après la sélection antibiotique pendant 2-3 semaines, CSEh avec l'ADN correctement intégré peuvent être récoltés manuellement, élargis et examinés d'abord par PCR, puis validés par transfert de Southern.
Protocol
Representative Results
Discussion
La génération de lignées cellulaires rapporteurs offre un moyen puissant pour suivre, visualiser et d'isoler les cellules d'intérêt à partir d'une population hétérogène provenant de CSEh. Cependant, le ciblage génique par recombinaison homologue classique s'est avérée être extrêmement inefficace pour CES de l'homme 3. Dans ce protocole, nous décrivons une technique relativement simple pour introduire un RP dans l'exon l'un des locus Pitx3, dans CSEh en utili…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Travaux décrits dans ce protocole a été rendue possible grâce au financement du gouvernement de Victoria dans le cadre d'une alliance de collaboration avec l'Institut californien pour la médecine régénérative (CIRM).
Materials
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer – 40um | BD Biosciences | 352340 | |
| 33mm – 0.22 um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
Riferimenti
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
- Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential. Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).
- Collin, J., Lako, M. Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells. Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).
- Carroll, D. Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents. Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).
- Boch, J., Bonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).
- Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).
- Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).
- Smidt, M. P., et al. A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).
