Zinkfinger-Nuklease Verbesserte Gene Targeting in humanen embryonalen Stammzellen
Summary
Reporterzelllinien bieten ein Mittel, um zu visualisieren, zu verfolgen und zu isolieren Zellen von Interesse aus heterogenen Populationen. Jedoch Gen-Targeting unter Verwendung von herkömmlichen homologen Rekombination in embryonalen Stammzellen äußerst ineffizient. Hier beschreiben wir Targeting ZNS Mittelhirn spezifischen Transkriptionsfaktor PITX3 Ortes mit EGFP mit Zink-Finger-Nuklease verbesserte homologe Rekombination.
Abstract
Eine große Einschränkung mit den aktuellen menschlichen embryonalen Stammzellen (ESC) Differenzierungsprotokollen ist die Erzeugung von heterogenen Zellpopulationen. Diese Kulturen enthalten die Zellen von Interesse, sondern auch mit undifferenzierten WSR nichtneuralen Derivaten und anderen neuronalen Subtypen verunreinigt. Dies beschränkt ihre Verwendung in in vitro-und in vivo-Anwendungen, beispielsweise in vitro-Modellierung für die Arzneimittelentdeckung oder Zellersatztherapie. Zur Überwindung dieser, Reporterzelllinien, die ein Mittel zur Visualisierung, zu verfolgen und zu isolieren Zellen von Interesse anbieten, können entwickelt werden. Um dies jedoch in menschlichen embryonalen Stammzellen zu erreichen über konventionellen homologen Rekombination ist äußerst ineffizient. Dieses Protokoll beschreibt Targeting der Hypophyse Homöobox 3 (PITX3) Locus in menschlichen embryonalen Stammzellen mit maßgeschneiderten Zink-Finger-Nukleasen, die ortsspezifische DNA-Doppelstrangbrüche vorstellen, zusammen mit einemPITX3 – EGFP-spezifischen DNA-Donor-Vektor. Nach der Erzeugung des PITX3 Reporterzelllinie kann dann unter Verwendung veröffentlichter Protokolle für die Verwendung in Studien unterschieden werden, wie in vitro-Parkinson-Krankheit Modellierung oder Zellersatztherapie.
Introduction
Strom embryonalen Stammzellen (ESC) Differenzierungsprotokollen führen in heterogenen Zellpopulationen, insbesondere hinsichtlich der Ableitung von spezifischen neuronalen Phänotypen. Obwohl Kulturen enthalten die gewünschte Mobil Phänotyp, andere neuronale, sind nicht-neuronalen und un-differenzierten Zelltypen häufig vorhanden 1. Diese Eigenschaften beschränken die Anwendung der ESC abgeleiteten Zellquellen für Zellersatztherapie und in vitro-Krankheitsmodelle.
Genetische Reporterzelllinien bieten ein Mittel, um zu visualisieren, zu verfolgen und zu isolieren Zellen von Interesse, vorausgesetzt, dass die Expression des Reporterproteins (RP) reproduziert endogene Expression. Verwendung von Promotoren, die unmittelbar stromaufwärts von einem Gen kodierende Region kann verwendet werden, um rohe genetische Reporter abgeleitet werden, sondern solche Konstrukte fehlen die genaue regulatorische Elemente, die endogene Genexpression zu steuern. Im Gegensatz dazu bietet der homologen RekombinationMöglichkeit, High-Fidelity-Expression des RP zu gewährleisten. In der Vergangenheit Targeting-Vektoren für die homologe Rekombination an bestimmten Loci von Interesse entworfen wurden zur RPs in Maus WSR (mESCs) Ziel unter Verwendung von Elektroporation als Mittel zur DNA-Abgabe 1,2. Doch die Generation der Reporterzelllinien über herkömmliche homologen Rekombination ist extrem ineffizient für den menschlichen WSR (hES-Zellen) und damit nur in einer Handvoll von Fällen (3 Bewertung) dokumentiert. Durch die Verwendung eines manipulierten chimären Protein, das eine Fusion eines FokI Nukleaseaktivität mit ortsspezifischen Zinkfingermotiven, die zusammen als Zinkfinger-Nucleasen (ZFNs) bekannt ist, DNA-Doppelstrangbrüche können an vorbestimmten Loci eingeführt werden. Wenn ein DNA-Vektor mit Homologie zu beiden Seiten des DNA-Doppelstrangbruch zugesetzt wird, kann die genomische Stelle durch homologe Rekombination repariert werden, so dass der Einbau der DNA-Donor-Sequenz. Diese Technik hat sich als nützlich erwiesen foder genomische Bearbeitung sowohl in primären humanen Zellen 4,5 und 6,7 HES. Neuere Arbeiten genutzt hat Transkriptionsaktivator-wie Effektor Nukleasen (Talens), Transkriptionsfaktoren durch Pflanzenpathogene verwendet 8, bei der Gestaltung von standortspezifischen Nukleasen 9 unterstützen.
In dem folgenden Protokoll zeigen wir die Erzeugung einer HES-Reporterzelllinie durch Elektroporation eines EGFP enthaltende homologe Zielvektor 6 zusammen mit ZFNs der menschlichen Hypophysen-Homeobox-3 (PITX3) Locus. Nach Antibiotika-Selektion für 2-3 Wochen kann mit hES richtig integriert DNA manuell abgeholt werden, erweitert und gesiebt zunächst über PCR und anschließend durch Southern Blotting validiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Erzeugung von Reporterzelllinien bietet ein leistungsfähiges Mittel zu verfolgen, zu visualisieren und zu isolieren Zellen von Interesse aus einer heterogenen Population von hES-Zellen abgeleitet. Allerdings Gen-Targeting über herkömmliche homologe Rekombination hat sich als äußerst ineffizient für den menschlichen WSR 3 zu sein. In diesem Protokoll beschreiben wir eine relativ einfache Technik für die Einführung eines RP in Exon eines der PITX3 Ort, in hES-Zellen mittels eines allgemein …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
In diesem Protokoll beschriebenen Arbeiten wurden durch Mittel aus der viktorianischen Regierung als Teil eines kollaborativen Allianz mit dem kalifornischen Institut für Regenerative Medizin (CIRM) möglich.
Materials
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer – 40um | BD Biosciences | 352340 | |
| 33mm – 0.22 um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
Riferimenti
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