मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में लक्ष्य निर्धारण जिंक उंगली Nuclease बढ़ी जीन
Summary
रिपोर्टर सेल लाइनों, कल्पना ट्रैक और विषम आबादी से ब्याज की कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक साधन प्रदान करते हैं. हालांकि, जीन को लक्षित मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में पारंपरिक मुताबिक़ पुनर्संयोजन का उपयोग अत्यंत अक्षम है. इस के साथ साथ, हम जस्ता उंगली nuclease बढ़ाया मुताबिक़ पुनर्संयोजन का उपयोग EGFP साथ सीएनएस मध्यमस्तिष्क विशिष्ट प्रतिलेखन कारक PITX3 ठिकाना को लक्षित वर्णन.
Abstract
वर्तमान मानव भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) भेदभाव प्रोटोकॉल के साथ एक प्रमुख सीमा विषम सेल आबादी की पीढ़ी है. इन संस्कृतियों ब्याज की कोशिकाओं होते हैं, लेकिन यह भी undifferentiated ESCs, गैर तंत्रिका डेरिवेटिव और अन्य न्यूरोनल उपप्रकार साथ दूषित कर रहे हैं. यह इन विट्रो में में और ऐसी दवाओं की खोज या सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी के लिए इन विट्रो मॉडलिंग के रूप में विवो अनुप्रयोगों में उनके उपयोग की सीमा. इस पर काबू पाने में मदद करने के लिए, कल्पना ट्रैक और ब्याज की कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक साधन प्रदान करते हैं, जो संवाददाता सेल लाइनों,, इंजीनियर हो सकता है. पारंपरिक मुताबिक़ पुनर्संयोजन अत्यंत अक्षम है के माध्यम से हालांकि, मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए. इस प्रोटोकॉल एक साथ एक साथ, पीयूष homeobox मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में 3 (PITX3) लोकस साइट विशेष डबल कतरा डीएनए टूट परिचय जो कस्टम डिजाइन जस्ता उंगली न्युक्लिअसिज़, का उपयोग करने का लक्ष्यीकरण का वर्णनPITX3 – EGFP -specific डीएनए दाता वेक्टर. PITX3 संवाददाता सेल लाइन की पीढ़ी के बाद, यह तो ऐसे में इन विट्रो पार्किंसंस रोग मॉडलिंग या सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी के रूप में पढ़ाई के लिए उपयोग में प्रकाशित प्रोटोकॉल का उपयोग भेदभाव किया जा सकता है.
Introduction
वर्तमान भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) भेदभाव प्रोटोकॉल विशेष रूप से विशिष्ट neuronal phenotypes की व्युत्पत्ति के संबंध में, विषम सेल आबादी में परिणाम. संस्कृतियों वांछित सेलुलर phenotype, अन्य न्यूरोनल होते हैं इस प्रकार, हालांकि, गैर neuronal और संयुक्त राष्ट्र के विभेदित सेल प्रकार अक्सर 1 मौजूद हैं. इन विशेषताओं ईएससी के आवेदन सेल प्रतिस्थापन चिकित्सा में उपयोग के लिए और इन विट्रो रोग मॉडलिंग में सेल के सूत्रों व्युत्पन्न सीमा.
जेनेटिक संवाददाता सेल लाइनों, कल्पना ट्रैक और ब्याज की कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक साधन प्रदान करते हैं, संवाददाता प्रोटीन (आरपी) की अभिव्यक्ति अंतर्जात अभिव्यक्ति reproduces कि प्रदान की है. एक जीन कोडिंग क्षेत्र के तुरंत नदी के ऊपर प्रमोटरों का उपयोग कच्चे आनुवंशिक संवाददाताओं से प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन इस तरह के निर्माणों अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित कि सटीक नियामक तत्वों की कमी है. इसके विपरीत, मुताबिक़ पुनर्संयोजन प्रदान करता हैअवसर आरपी की उच्च निष्ठा अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए. अतीत में, ब्याज की विशिष्ट loci में मुताबिक़ पुनर्संयोजन के लिए बनाया गया वैक्टर को लक्षित डीएनए वितरण 1,2 के एक साधन के रूप में electroporation का उपयोग माउस ESCs (mESCs) में आर पी एस लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि पारंपरिक मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से संवाददाता सेल लाइनों की पीढ़ी मानव ESCs (hESCs) के लिए अत्यंत अक्षम है, और इस प्रकार केवल (3 में समीक्षा) मामलों की एक मुट्ठी में दर्ज़ किया गया है. जस्ता उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs) के रूप में सामूहिक रूप से जाना जाता साइट विशेष जस्ता उंगली रूपांकनों, के साथ एक Fok मैं nuclease की एक संलयन युक्त एक इंजीनियर काइमेरिक प्रोटीन, उपयोग करके डीएनए डबल कतरा टूटता पूर्व निर्धारित जीनोमिक loci में पेश किया जा सकता है. डीएनए डबल कतरा तोड़ दोनों पक्षों के लिए अनुरूपता साथ एक डीएनए वेक्टर जोड़ा जाता है, जीनोमिक साइट डीएनए दाता अनुक्रम का समावेश की अनुमति, मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा मरम्मत की जा सकती है. इस तकनीक को उपयोगी च साबित कर दिया हैया मानव प्राथमिक कोशिकाओं 4,5 और hESCs 6,7 दोनों में जीनोमिक संपादन. और हाल ही में काम का उपयोग किया गया है प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS), संयंत्र द्वारा प्रयोग किया जाता प्रतिलेखन कारक साइट विशेष न्युक्लिअसिज़ 9 के डिजाइन में सहायता करने के लिए, 8 रोगजनकों.
निम्नलिखित प्रोटोकॉल में हम मानव पिट्यूटरी homeobox 3 (PITX3) लोकस के लिए ZFNs साथ एक साथ मुताबिक़ लक्ष्यीकरण वेक्टर 6 युक्त एक EGFP की electroporation द्वारा एक hESC संवाददाता सेल लाइन की पीढ़ी प्रदर्शित करता है. 2-3 सप्ताह के लिए एंटीबायोटिक चयन के बाद, सही ढंग से एकीकृत डीएनए के साथ hESCs मैन्युअल उठाया विस्तार और पीसीआर के माध्यम से शुरू में जांच की, और बाद में दक्षिणी सोख्ता द्वारा मान्य किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
संवाददाता सेल लाइनों की पीढ़ी, ट्रैक कल्पना और hESCs से निकाली गई एक विषम जनसंख्या से ब्याज की कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक शक्तिशाली साधन प्रदान करता है. हालांकि, पारंपरिक मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस प्रोटोकॉल में वर्णित कार्य पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (सीआईआरएम) के साथ एक सहयोगी गठबंधन के हिस्से के रूप में विक्टोरियन सरकार से धन के द्वारा ही संभव बनाया गया था.
Materials
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer – 40um | BD Biosciences | 352340 | |
| 33mm – 0.22 um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
Riferimenti
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