Zinc-finger nucleasi avanzata gene targeting in cellule staminali embrionali umane
Summary
Linee cellulari Reporter offrono un mezzo per visualizzare, monitorare e isolare le cellule di interesse da popolazioni eterogenee. Tuttavia,-gene targeting utilizzando convenzionale ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali umane è estremamente inefficiente. Qui, descriviamo il targeting CNS mesencefalo specifico PITX3 locus fattore di trascrizione con EGFP utilizzando zinc-finger nucleasi avanzata ricombinazione omologa.
Abstract
Una limitazione importante con cellule staminali embrionali (ESC) protocolli di differenziazione attuali è la generazione di popolazioni cellulari eterogenee. Queste culture contengono le cellule di interesse, ma sono anche contaminati con i CES indifferenziate, derivati non-neurali e altri sottotipi neuronali. Questo limita il loro uso in vitro ed in vivo applicazioni, come la modellazione in vitro per la scoperta di farmaci o terapia di sostituzione cellulare. Per aiutare a superare questo, linee cellulari giornalista, che offrono un mezzo per visualizzare, monitorare e isolare le cellule di interesse, possono essere progettati. Tuttavia, per raggiungere questo obiettivo in cellule staminali embrionali umane via convenzionale ricombinazione omologa è estremamente inefficiente. Questo protocollo descrive il targeting della homeobox pituitaria 3 (PITX3) locus in cellule staminali embrionali umane utilizzando progettati su misura nucleasi zinc-finger, che introducono site-specific doppio filamento rotture del DNA, insieme ad unPITX3 – EGFP -specifica vettore donatore del DNA. Dopo la generazione della linea cellulare PITX3 giornalista, può quindi essere differenziato utilizzando protocolli pubblicati da utilizzare in studi in vitro come modelli di malattia o terapia di sostituzione cellulare di Parkinson.
Introduction
Cellule staminali embrionali (ESC) protocolli di differenziazione correnti provocano popolazioni cellulari eterogenee, soprattutto per quanto riguarda la derivazione di specifici fenotipi neuronali. Così, anche se le culture contengono il fenotipo cellulare desiderato, altro neuronale, tipi di cellule non-neuronali e non-differenziati sono spesso presenti 1. Queste caratteristiche limitano l'applicazione del CES derivato fonti di cellule per l'uso in terapia di sostituzione cellulare e nella modellazione delle malattie vitro.
Linee cellulari giornalista genetici offrono un mezzo per visualizzare, monitorare e isolare le cellule di interesse, a condizione che l'espressione della proteina reporter (RP) riproduce l'espressione endogena. L'uso di promotori immediatamente a monte di una regione del gene codificante può essere usata per derivare reporter genetici grezzi ma tali costrutti mancano i precisi elementi regolatori che controllano l'espressione del gene endogeno. Al contrario, la ricombinazione omologa offre laopportunità di garantire l'espressione ad alta fedeltà del RP. In passato, il targeting vettori progettati per ricombinazione omologa a specifici loci di interesse sono stati utilizzati per RP di topo (CES mESCs) bersaglio utilizzando elettroporazione come mezzo di consegna DNA 1,2. Tuttavia la generazione di linee cellulari giornalista via convenzionale ricombinazione omologa è estremamente inefficiente per CES umane (hESC), e, quindi, è stata documentata solo in una manciata di casi (recensito in 3). Utilizzando una proteina chimerica ingegneria contenente una fusione di una nucleasi Fok I con motivi zinc-finger site-specific, conosciuti collettivamente come zinc-finger nucleasi (ZFNs), DNA rotture del doppio filamento possono essere introdotti a livello pre-determinati loci genomici. Quando si aggiunge un vettore di DNA con omologia a entrambi i lati del DNA rottura a doppio filamento, il sito genomico può essere riparato tramite ricombinazione omologa, consentendo l'inserimento della sequenza di DNA donatore. Questa tecnica si è dimostrata utile fo editing genomico in cellule primarie umane 4,5 e 6,7 hESC. Più recente lavoro ha utilizzato trascrizione attivatore-come effettrici nucleasi (Talens), fattori di trascrizione utilizzati da impianti patogeni 8, per aiutare nella progettazione di site-specific nucleasi 9.
Nel seguente protocollo dimostriamo la generazione di una linea cellulare hESC giornalista da elettroporazione di un EGFP contenente omologa vettore targeting 6 insieme ZFNs per l'homeobox pituitaria umana 3 (PITX3) locus. Dopo la selezione antibiotica per 2-3 settimane, hESC con il DNA integrato correttamente possono essere raccolti manualmente, ampliati e proiettati inizialmente tramite PCR, e successivamente convalidati da Southern blotting.
Protocol
Representative Results
Discussion
La generazione di linee cellulari giornalista offre un potente mezzo per monitorare, visualizzare e isolare le cellule di interesse da una popolazione eterogenea derivato da hESC. Tuttavia, gene targeting via convenzionale ricombinazione omologa ha dimostrato di essere estremamente inefficiente per CES umani 3. In questo protocollo si descrive una tecnica relativamente semplice per l'introduzione di una RP in esone uno dei locus PITX3, in hESC utilizzando un vettore targeting ampiamente disponibi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro descritto in questo protocollo è stato reso possibile da un finanziamento da parte del governo vittoriana come parte di un'alleanza di collaborazione con l'Istituto californiano per la medicina rigenerativa (CIRM).
Materials
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer – 40um | BD Biosciences | 352340 | |
| 33mm – 0.22 um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
Riferimenti
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
- Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential. Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).
- Collin, J., Lako, M. Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells. Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).
- Carroll, D. Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents. Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).
- Boch, J., Bonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).
- Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).
- Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).
- Smidt, M. P., et al. A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).
