Sink-finger Nuclease Forbedret Gene Targeting i humane embryonale stamceller
Summary
Rapportørcellelinjer gir et middel for å visualisere, spore og isolere celler av interesse fra heterogene populasjoner. Det er imidlertid gene-rettet ved hjelp av konvensjonelle homolog rekombinasjon i humane embryoniske stamceller ekstremt ineffektiv. Heri beskriver vi målretting CNS midthjernen spesifikk transkripsjonsfaktor PITX3 locus med EGFP bruker sink-finger nuclease forbedret homolog rekombinasjon.
Abstract
En stor begrensning med dagens menneskelige embryonale stamceller (ESC) differensiering protokoller er den generasjonen av heterogene cellepopulasjoner. Disse kulturene inneholder celler av interesse, men er også forurenset med udifferensierte ESCs, ikke-nevrale derivater og andre neuronale subtyper. Dette begrenser deres anvendelse i in vitro-og in vivo-anvendelser, for eksempel in vitro modell for medisiner eller celleerstatningsterapi. For å hjelpe overvinne dette, reporter cellelinjer, som tilbyr et middel til å visualisere, spore og isolere celler av interesse, kan være konstruert. Men for å oppnå dette i humane embryonale stamceller via konvensjonell homolog rekombinasjon er ekstremt ineffektiv. Denne protokollen beskriver målretting av hypofysen homeobox 3 (PITX3) locus i humane embryonale stamceller ved hjelp av tilpasset designet sink-finger nukleaser, som introduserer stedsspesifikke dobbel tråd DNA pauser, sammen med enPITX3 – EGFP -spesifikk DNA donor vektor. Etter genereringen av PITX3 rapportørcellelinje, kan den deretter bli differensiert ved hjelp av publiserte protokoller for bruk i studier slik som in vitro-Parkinsons sykdom-modellering eller celleerstatningsterapi.
Introduction
Gjeldende embryonale stamceller (ESC) differensiering protokoller resultere i heterogene cellepopulasjoner, spesielt med hensyn til avledning av spesifikke nevronale fenotyper. Således, selv om kulturer inneholder den ønskede cellulære fenotype, annen neuronal, ikke-neuronal og un-differensierte celletyper er ofte tilstede 1. Disse egenskapene begrenser anvendelsen av ESC avledet cellekilder for anvendelse i celleerstatningsterapi og in vitro sykdom modellering.
Genetiske rapportørcellelinjer gir et middel for å visualisere, spore og isolere celler av interesse, under forutsetning av at ekspresjon av rapportørprotein (RP) reproduserer endogen ekspresjon. Bruk av promotorer umiddelbart oppstrøms av et gen kodende område kan brukes til å utlede råolje genetiske reportere, men slike konstruksjoner mangler de nøyaktige regulatoriske elementer som kontrollerer genekspresjon endogent. I motsetning til dette har homolog rekombinasjon imulighet til å sikre high-fidelity uttrykk for RP. I det siste har målretting vektorer konstruert for homolog rekombinasjon ved bestemte geometriske steder av interesse blitt brukt til å målrette RPs i mus ESCs (mESCs) under anvendelse av elektroporering som et middel for DNA leverings 1,2. Men den generasjonen av reporter cellelinjer via konvensjonell homolog rekombinasjon er ekstremt ineffektiv for menneske ESCs (hESCs), og dermed har bare blitt dokumentert i en håndfull saker (anmeldt i 3). Ved å bruke en konstruert kimert protein som inneholder en blanding av en Fok jeg nuclease med stedsspesifikke sinkfingermotiv, kjent under samle sink-finger nukleaser (ZFNs), DNA-dobbelttrådbrudd kan bli innført på forhåndsbestemt genomisk loci. Når en DNA-vektor med homologi til begge sider av den doble DNA-tråd pause blir tilsatt, kan den genomiske sete repareres ved homolog rekombinasjon, slik at inkorporering av donor-DNA-sekvensen. Denne teknikken har vist seg nyttig feller genomisk redigering i både menneskelige primære celler 4,5 og hESCs 6,7. Nyere arbeid har utnyttet transkripsjons aktivator lignende effektor nukleaser (Talens), transkripsjonsfaktorer som brukes av plantepatogener 8, til hjelp i utformingen av stedsspesifikke nukleaser ni.
I den følgende protokoll demonstrerer vi generering av et hESC rapportørcellelinje ved elektroporering av en EGFP inneholdende homolog målretting vektor 6 sammen med ZFNs for human hypofyse homeobox 3 (PITX3) locus. Etter antibiotika utvalg i 2-3 uker, kan hESCs med riktig integrert DNA manuelt plukket, utvidet og skjermet i utgangspunktet via PCR, og senere validert av Southern blotting.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generering av reporter cellelinjer tilbyr et kraftig middel til å spore, visualisere og isolere celler av interesse fra en heterogen befolkning avledet fra hESCs. Imidlertid har genet målretting via konvensjonell homolog rekombinasjon vist seg å være meget ineffektive for menneske ESCs 3. I denne protokollen beskriver vi en relativt enkel teknikk for innføring av en RP i exon én av PITX3 locus, i hESCs ved hjelp av en allment tilgjengelig målretting vektor sammen med ZFNs. I våre hender genet…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet som er beskrevet i denne protokollen ble gjort mulig med midler fra den viktorianske regjeringen som en del av et samarbeids allianse med Californian Institute for Regenerative Medicine (CIRM).
Materials
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer – 40um | BD Biosciences | 352340 | |
| 33mm – 0.22 um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
Riferimenti
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
- Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential. Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).
- Collin, J., Lako, M. Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells. Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).
- Carroll, D. Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents. Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).
- Boch, J., Bonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).
- Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).
- Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).
- Smidt, M. P., et al. A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).
