Цинк-палец Nuclease Enhanced генного таргетинга в человеческих эмбриональных стволовых клеток
Summary
Линии Репортер сотовые предлагают средства для визуализации, отслеживать и изолировать клетки интерес гетерогенных популяций. Тем не менее, ген-таргетинга с использованием обычного гомологичной рекомбинации в человеческих эмбриональных стволовых клеток крайне неэффективно. Здесь мы опишем ориентации ЦНС среднего мозга конкретного фактора транскрипции Pitx3 локуса EGFP помощью цинка пальца нуклеазы повышенную гомологичной рекомбинации.
Abstract
Одним из основных ограничений с нынешних человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) дифференцировки протоколов является генерация гетерогенных популяций клеток. Эти культуры содержат клетки интерес, но также загрязнены недифференцированных ЭСК, не-нейронных производных и других нервных подтипов. Это ограничивает их использование в в пробирке и в естественных приложений, таких как моделирование в пробирке для открытия новых лекарств или заместительной клеточной терапии. Чтобы помочь преодолеть это, клеточные линии репортер, которые предлагают средства для визуализации, дорожки и изолировать клетки интерес, могут быть спроектированы. Тем не менее, для достижения этой цели в человеческих эмбриональных стволовых клеток с помощью обычного гомологичной рекомбинации крайне неэффективно. Этот протокол описывает адресности гипофиза гомеобоксных 3 (Pitx3) локуса в человеческих эмбриональных стволовых клеток с помощью специально созданных нуклеазы цинка пальцев, которые вводят двунитевых разрывов ДНК, специфичные для конкретного, вместе сPitx3 – EGFP -специфический вектор донор ДНК. После генерации линии клеток Pitx3 репортера, он может быть дифференцированы с помощью опубликованные протоколы для использования в исследованиях, такие как в пробирке моделирования заболевание или клеточной заместительной терапии Паркинсона.
Introduction
Текущие эмбриональных стволовых клеток (ESC) дифференциации протоколы привести в гетерогенных клеточных популяций, особенно в отношении получения конкретных нейронных фенотипов. Таким образом, хотя культуры содержат желаемый клеточный фенотип, другой нейронов, не нейронов и не-дифференцированные типы клеток часто присутствуют 1. Эти характеристики ограничивают применение ESC получены клеточные источники для использования в клеточной заместительной терапии, и в моделировании пробирке заболевания.
Генетические линии репортер сотовые предлагают средства для визуализации, отслеживать и изолировать клетки интерес, при условии, что выражение репортера белка (РП) воспроизводит эндогенной экспрессии. Использование промоторов, которые непосредственно выше по потоку от области гена, кодирующего могут быть использованы для получения сырых генетические репортеров, но такие конструкции не имеют точные регуляторные элементы, которые контролируют экспрессию эндогенного гена. В отличие от этого, гомологичной рекомбинации предлагаетвозможность обеспечить высококачественный выражение РП. В прошлом ориентации векторов, предназначенных для гомологичной рекомбинации в конкретной локусов интерес были использованы для целевой RPS в мышиных ЭСК (mESCs) с помощью электропорации в качестве средства доставки ДНК 1,2. Однако генерация линий репортеров клеток через обычной гомологичной рекомбинации крайне неэффективно для эмбриональных клеток (ЭСК), и, таким образом, только были зарегистрированы в нескольких случаев (обзор 3). Используя инженерии химерный белок, содержащий слияние с Фок I нуклеазы с конкретным участкам мотивов цинка пальцев, известных под общим названием цинка пальцев нуклеазы (ZFNs), ДНК двухцепочечной перерывы могут быть введены в заранее определенном локусов генома. Когда ДНК-вектор с гомологии с обеих сторон двухцепочечной ДНК перерыва добавляется, геномную сайт может быть восстановлен с помощью гомологичной рекомбинации, что позволяет включение последовательности ДНК донора. Эта техника оказалась полезной Fили геномной редактирования в обоих человека первичных клеток 4,5 и ЭСК 6,7. Более поздние работы, используемые активатора транскрипции, как эффекторные нуклеазы (Talens), транскрипционные факторы, используемые патогенов растений 8, чтобы помочь в разработке нуклеаз сайт-специфических 9.
В следующем протоколе мы демонстрируем поколение линии чЭСК репортера клеток путем электропорации в EGFP содержащей гомологичной вектора направленного 6 вместе с ZFNs для человеческого гипофиза гомеобоксного 3 (Pitx3) локуса. После выбора антибиотика в течение 2-3 недель, ЭСК с правильно интегрированной ДНК можно вручную выбрал, расширен и скрининг первоначально методом ПЦР, а затем подтверждено Саузерн-блоттинга.
Protocol
Representative Results
Discussion
Поколение линий репортеров клеточных предлагает мощные средства для отслеживания, визуализации и выделения клеток, представляющих интерес с гетерогенной популяции, полученной из ЭСК. Тем не менее, целенаправленное изменение генов с помощью обычной гомологичной рекомбинации оказала…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа описано в данном протоколе стало возможным благодаря финансированию викторианской правительства в рамках совместного альянса с калифорнийской Института регенеративной медицины (CIRM).
Materials
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer – 40um | BD Biosciences | 352340 | |
| 33mm – 0.22 um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
Riferimenti
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
- Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential. Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).
- Collin, J., Lako, M. Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells. Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).
- Carroll, D. Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents. Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).
- Boch, J., Bonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).
- Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).
- Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).
- Smidt, M. P., et al. A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).
