Nucleasa dedo de zinc-gen mejorada en células madre embrionarias humanas
Summary
Líneas celulares Reporter ofrecen un medio para visualizar, controlar y aislar las células de interés por parte de las poblaciones heterogéneas. Sin embargo, gen de la orientación mediante recombinación homóloga convencional en células madre de embriones humanos es extremadamente ineficiente. Aquí se describe la orientación del SNC locus cerebro medio específico Pitx3 factor de transcripción con EGFP usando nucleasa dedo de zinc mejorado recombinación homóloga.
Abstract
Una de las principales limitaciones con células madre embrionarias (ESC) protocolos de diferenciación actuales es la generación de poblaciones de células heterogéneas. Estos cultivos contienen las células de interés, pero también se contaminan con los CES indiferenciadas, derivados no neurales y otros subtipos neuronales. Esto limita su uso en in vitro y en aplicaciones in vivo, tales como el modelado in vitro para el descubrimiento de fármacos o la terapia de reemplazo celular. Para ayudar a superar esto, las líneas celulares reporteras, que ofrecen un medio para visualizar, controlar y aislar las células de interés, se pueden diseñar. Sin embargo, para lograr esto en células madre embrionarias humanas a través de recombinación homóloga convencional es extremadamente ineficiente. Este protocolo describe la orientación de la homeobox pituitaria 3 (Pitx3) locus de células madre embrionarias humanas mediante nucleasas de dedos de zinc de diseño personalizado, que introducen rupturas de doble hebra de ADN específicas del lugar, junto con unPitx3 – EGFP específico de vector donante de ADN. Después de la generación de la línea celular reportera Pitx3, entonces se puede diferenciar usando protocolos publicados para su uso en estudios in vitro tales como el modelado de la enfermedad o el reemplazo de células en la terapia de Parkinson.
Introduction
Células madre embrionarias (ESC) protocolos de diferenciación actuales resultan en poblaciones de células heterogéneas, particularmente con respecto a la derivación de fenotipos neuronales específicas. Por lo tanto, aunque los cultivos contienen el fenotipo celular deseada, otra neuronal, tipos celulares disociados de la ONU no neuronal y están a menudo presentes 1. Estas características limitan la aplicación de ESC deriva fuentes de células para su uso en la terapia de reemplazo celular y en el modelado de la enfermedad vitro.
Líneas celulares reporteras genéticos ofrecen un medio para visualizar, rastrear y aislar las células de interés, a condición de que la expresión de la proteína indicadora (RP) reproduce la expresión endógena. El uso de promotores inmediatamente aguas arriba de una región codificante del gen se puede utilizar para derivar reporteros genéticos crudo pero tales construcciones carecen de los elementos reguladores precisos que controlan la expresión génica endógena. En contraste, la recombinación homóloga ofrece laoportunidad de asegurar la expresión de alta fidelidad de la RP. En el pasado, apuntando vectores diseñados para la recombinación homóloga en los loci específico de interés se han utilizado para RPs en ratón CES (mESCs) apuntar usando electroporación como medio de suministro de ADN 1,2. Sin embargo, la generación de líneas celulares reportero a través de recombinación homóloga convencional es extremadamente ineficiente para CME humanas (hESCs), y por tanto sólo se ha documentado en un puñado de casos (revisado en 3). Mediante el uso de una proteína quimérica de ingeniería que contiene una fusión de una nucleasa Fok I con motivos de dedos de zinc específicos del sitio, conocidas colectivamente como nucleasas de dedos de zinc (ZFNs), la DNA se rompe la doble cadena se pueden introducir en loci genómico predeterminado. Cuando se añade un vector de ADN con homología a ambos lados de la ruptura del ADN de doble cadena, el sitio genómico se puede reparar mediante recombinación homóloga, permitiendo la incorporación de la secuencia donante de ADN. Esta técnica ha demostrado ser útil fo edición genómico tanto en las células primarias humanas 4,5 y 6,7 hESCs. Un trabajo más reciente de transcripción ha utilizado activador de nucleasas efectoras (Talens), factores de transcripción utilizados por fitopatógenos 8, para ayudar en el diseño de nucleasas específicas de sitio 9.
En el siguiente protocolo se demuestra la generación de una línea celular de células madre reportero por electroporación de un EGFP que contiene homóloga vector de orientación 6 junto con ZFNs para el homeobox pituitaria humana 3 (Pitx3) locus. Tras la selección de antibióticos durante 2-3 semanas, hESCs con ADN integrado correctamente pueden ser recogidos manualmente, se expandieron y se seleccionaron inicialmente mediante PCR, y posteriormente validados por transferencia de Southern.
Protocol
Representative Results
Discussion
La generación de líneas celulares reporteras ofrece un medio poderoso para realizar un seguimiento, visualizar y aislar células de interés a partir de una población heterogénea derivadas de hESCs. Sin embargo, la orientación de genes por recombinación homóloga convencional ha demostrado ser extremadamente ineficiente para humanos CES 3. En este protocolo se describe una técnica relativamente sencilla para la introducción de un RP en el exón uno de los locus Pitx3, en hESCs usando un vecto…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo descrito en este protocolo fue posible gracias a la financiación del Gobierno de Victoria como parte de una alianza de colaboración con el Instituto de California para la Medicina Regenerativa (CIRM).
Materials
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer – 40um | BD Biosciences | 352340 | |
| 33mm – 0.22 um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
Riferimenti
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