Zink-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting i mänskliga embryonala stamcellslinjer
Summary
Reporter cellinjer erbjuder ett sätt att visualisera, spåra och isolera celler av intresse från heterogena populationer. Dock är gen-inriktning med konventionell homolog rekombination i humana embryonala stamceller extremt ineffektivt. Häri beskriver vi riktar CNS hjärnan specifik transkriptionsfaktor PITX3 locus med EGFP användning av zink-finger nukleas förstärkt homolog rekombination.
Abstract
En stor begränsning med dagens mänskliga embryonala stamceller (ESC) differentieringsprotokoll är den generation av heterogena cellpopulationer. Dessa kulturer innehåller cellerna av intresse, men är också förorenat med odifferentierade ekonomiska och sociala råd, icke-neurala derivat och andra neuronala subtyper. Detta begränsar deras användning i in vitro och in vivo applikationer, såsom in vitro-modeller för läkemedelsutveckling eller cellersättningsterapi. För att lösa det här, reporter cellinjer, som erbjuder ett sätt att visualisera, spåra och isolera celler av intresse, kan manipuleras. Men för att uppnå detta på mänskliga embryonala stamceller genom konventionell homolog rekombination är extremt ineffektivt. Detta protokoll beskriver inriktning av hypofys homeobox 3 (PITX3) locus i humana embryonala stamceller med hjälp av specialdesignade zinkfinger nukleaser, som inför platsspecifika dubbelsträngat DNA raster, tillsammans med enPITX3 – EGFP specifik DNA-donatorvektor. Efter alstringen av PITX3 reporter-cellinje, kan det sedan differentieras med användning av publicerade protokoll för användning i studier som in vitro Parkinsons sjukdom modellering eller cellersättningsterapi.
Introduction
Aktuella embryonala stamceller (ESC) differentieringsprotokoll leda heterogena cellpopulationer, särskilt med avseende på härledningen av specifika neuronala fenotyper. Även om kulturer innehåller den önskade cellulära fenotyp, andra neuronala, icke-neuronala och un-differentierade celltyper är ofta närvarande 1. Dessa egenskaper begränsa tillämpningen av ESC härledda cellkällor för användning i cellersättningsterapi och in vitro modellsjukdom.
Genetiska reporter cellinjer erbjuder ett sätt att visualisera, spåra och isolera celler av intresse, under förutsättning att uttrycket av reporterprotein (RP) återger endogen uttryck. Användning av promotorer omedelbart uppströms om en gen kodande region kan användas för att härleda råa genetiska reportrar men sådana konstruktioner saknar de exakta regulatoriska element som styr endogena genuttryck. Däremot erbjuder homolog rekombination imöjlighet att se till hifi-uttryck för RP. I det förflutna, targeting vektorer konstruerade för homolog rekombination vid specifika loci av intresse har använts för att rikta RP i mus ESCS (mESCs) med användning av elektroporering som ett sätt att DNA-leveransen 1,2. Men generering av reporter cellinjer via konventionella homolog rekombination är extremt ineffektivt för mänskliga ekonomiska och sociala råd (hESCs), och därför har endast dokumenterats i en handfull fall (över 3). Genom att använda en konstruerad chimär protein innehållande en fusion av en Fok I nukleas med platsspecifika zinkfingermotiv, kända som zinkfinger nukleaser (ZFNs), DNA dubbel-strängbrott kan införas på förutbestämd iska loci. När en DNA-vektor med homologi till båda sidorna av DNA-dubbelsträngbrott tillsätts, kan den genomiska platsen repareras genom homolog rekombination, vilket möjliggör inkorporeringen av DNA-donatorsekvens. Denna teknik har visat sig vara till nytta feller genom-redigering i både humana primära celler 4,5 och hESCs 6,7. Nyare arbete har utnyttjas transkriptions aktivator liknande effektor nukleaser (Talens), transkriptionsfaktorer som används av växtpatogener 8, för att hjälpa till i utformningen av platsspecifika nukleaser 9.
I följande protokoll visar vi genereringen av en hESC reporter cellinjen genom elektroporation av en EGFP innehållande homolog målinriktning vektor 6 tillsammans med ZFNs för det humana hypofys homeobox 3 (PITX3) locus. Efter antibiotikaselektion i 2-3 veckor, kan hESCs med korrekt integrerat DNA manuellt plockas expanderade och screenas initialt via PCR, och därefter bekräftats av Southern blotting.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genereringen av reporter cellinjer ger ett kraftfullt medel för att spåra, visualisera och isolera celler av intresse från en heterogen population härstammar från hESCs. Emellertid har genmålinriktning via konventionell homolog rekombination visat sig vara extremt ineffektivt för mänskliga ESCs 3. I detta protokoll beskriver vi en relativt enkel teknik för att införa en RP i exon ett av PITX3 locus, i hESCs med en allmänt tillgänglig målvektor tillsammans med ZFNs. I våra händer det ge…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet beskrivs i detta protokoll har gjorts möjlig genom finansiering från den viktorianska regeringen som en del av ett samarbete allians med den kaliforniska Institutet för regenerativ medicin (CIRM).
Materials
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer – 40um | BD Biosciences | 352340 | |
| 33mm – 0.22 um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
Riferimenti
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
- Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential. Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).
- Collin, J., Lako, M. Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells. Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).
- Carroll, D. Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents. Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).
- Boch, J., Bonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).
- Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).
- Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).
- Smidt, M. P., et al. A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).
