Denne protokollen forklarer primære Lgr5-positve organoid kultur og den påfølgende ytelsen retrovirale transduksjon. Dette gjør Cre-induserbar overekspresjon eller knockdown av den leverte transgenet og lar funksjonelle studier som skal gjennomføres i romanen in vitro organotypic modellsystem.
Lgr5-positive stamceller kan suppleres med viktige vekstfaktorer Egf, Noggin, og R-Spondin, som tillater oss å kultur stadig voksende primære 3D epiteliale strukturer in vitro. Både arkitektur og fysiologiske egenskapene til disse "mini-guts ', også kalt organoids, likne deres in vivo kolleger nøye. Dette gjør dem til et attraktivt modellsystem for den lille tarm epitel. Ved hjelp av retroviral transduksjon, kan funksjonelle gener nå utføres av betinget gen eller overekspresjon knockdown. Denne filmen demonstrerer fremgangsmåten i organoid kultur, generering av retrovirus, og retroviral transduksjon av organoids å bistå fenotypeanalyser av den lille tarm epitel in vitro. Denne nye organotypic modellsystem i kombinasjon med retrovirale mediert gen-ekspresjon gir et verdifullt verktøy for rask analyse av gen-funksjon in vitro uten behov for costly og tidkrevende for generering av transgene dyr.
High-throughput funksjonelle genetikk er nødvendig for å øke vår biologiske forståelse av kroppen, for å forbedre dagens grunnleggende vitenskap og medisin. Muse genetikk har vært gullstandarden for undersøkelse av gen-funksjon in vivo, selv om den både er tidkrevende og kostbare. Cellelinjer, som er den andre vanlige valg, har en høyere gjennomstrømning kapasitet samtidig er rimeligere. De er imidlertid hindret av deres manglende evne til å reprodusere den riktige mikromiljøet og dermed de fysiologiske responser sees in vivo. Derfor er det en utvetydig behov for en lett-å-håndtaket modellsystem som gjør det mulig kostnad / tidseffektiv høy gjennomstrømning analyse mens ligne de fysiologiske responser observert i di vivo transgene (tg) museforsøk.
For endodermal epitel en slik modell system dukket opp i 2009 1. Blant kunnskapen fra oppdagelsen av Lgr5-positive tarm stamceller bleinformasjon om den nisje som svarer til den ekstra-cellulære matriks og vekstfaktorer som er nødvendige for stamcelle vedlikehold. Utnytte denne informasjonen ble det mulig å etablere 'mini-guts' også kjent som organoids to. Nylig en konsensus nomenklatur for in vitro kulturer, hvor organoids er referert til som "enteroids ', ble foreslått tre. Som cellelinjer, de organoids er stadig voksende og lett å behandle med ligander og inhibitorer. Imidlertid, i stedet for å være to-dimensjonale de tredimensjonale selvorganiserende strukturer som beholder krypten-villus organisasjonen så vel som stamceller og differensierte celle linjer av tynntarmen (SI). Organoids bestå av et enkelt lag av epitelceller som omgir en luminal området. Utstående spirende strukturer tilsvarer tynntarms krypter inneholder stamcellelinjen. Start fra spissen av spirende struktur progenitorceller skille som de miriv mot epitel foring, hvor terminalt differensierte celler er skur inn i hulrommet. Sammenlignet med cellelinjer, dette ex vivo-system nærmere sammenfatter normal fysiologi og er derfor en lovende modellsystem for den lille tarm epitel.
I denne videoen protokollen av retrovirale transduksjon, presenterer vi en metode som gjør det mulig ex vivo genet funksjon studier i denne romanen organoid kultur system. Vi starter med å beskrive organoid kultur i en steg-for-steg måte, og fortsette ved å demonstrere generasjon av retrovirus fulgt av transduksjon prosedyren. Til slutt er det en seksjon for ytterligere råd for feilsøking. En fordel med denne teknikken er at den kan kombineres med levende avbildning eller medikamentscreening for å studere homeostase celle fate beslutninger og celle-celle interaksjoner i intestinal epitelium. På grunn av sin enkle arkitektur og høy omløpshastighet, organoids representerer en ideell modell system for å studere voksen stamcellebiologi. I tillegg retroviral transduksjon kan påføres organoids avledet fra pre-etablerte transgene mus, så vel som humane pasientprøver. Som knock-in og knock-out tilnærminger ikke kan utvides til mennesker, de menneskelige SI organoids utgjøre et attraktivt alternativ.
I sammendraget, genmanipulering gjennom retrovirale transduksjon tillater fenotypeanalyser i tynntarms organoids avledet fra mus eller menneskelige vevsprøver, og dermed utfyller muse genetikk og cellelinjer under åpning av nye veier for studier i humane avledet vev. Retrovirale transduksjon gjør gevinst-og taps-of-funksjon studier som skal utføres i organoid kultur system 4. Dette gjør det til en verdifull ressurs for å undersøke gen-funksjon, voksen stamcellebiologi og sykdom mens den er i samsvar med de tre Rs (reduksjon, raffinement, og erstatning).
For å oppnå høy transduksjon effektivitet visse aspekter er kritiske. Den ene er forbehandling av organoids med ENRWntNic media før de vedtar en runde cystisk form. Dette øker antallet av stamceller og derved muligheten for å oppnå en stabil integrering av transgenet, så vel som å øke overlevelsen av de SI organoids hele transduksjon prosedyren. En annen parameter er inkubasjonstiden følgende spinoculation. For kort eller for lang ruge resulterer i dårlig transduksjon effektivitet og dårlig overlevelse av organoids, henholdsvis. Den spinoculation trinnet er ikke avgjørende selv om det øker andelen transduserte organoids. Endelig er høy titer virus nøkkelen for vellykket transduksjon. Dette er avhengig av typen av emballasje cellelinje og virus. Kombinasjonen av platina-E-cellelinje og murine stamcelle virus (MSCV), ble funnet å produsere en titer høy nok for transduksjon av organoids.
ve_content "> Her er tips for feilsøking som kan bidra til å oppnå vellykket transduksjon. Først, dersom transfeksjon av emballasjen cellelinjen er dårlig, må du kontrollere at konfluens av cellene er mellom 70-80%, og at inkubasjonstid på pooled PEI-DNA-blandingen er mellom 20-30 min. overlevelsen av organoids under transduksjon sterkt avhengig av fragmentstørrelsen. For lang trypsinisering fører til at mesteparten av fragmenter for å bestå av mindre enn tre celler, og derved minsker organoid overlevelsesevne. annen faktor er aktiviteten av Wnt kondisjonerte medium, hvis aktivitet er for lav forsterke det gjennom tilsetning av CHIR99021 i en arbeidskonsentrasjon på 5 pM kan øke overlevelsen. CHIR99021 hemmer GSK3, noe som resulterer i økt Wnt signalering. Videre, Y-27362, som hindrer anoikis legges til transduksjon media for å forbedre organoid overlevelsesevne, siden organoids blir forstyrret til fragmenter (som inneholder 1-10 celler) før transduksjon. As60; nevnt ovenfor, bør inkubasjonstiden etter spinoculation ikke overstige 6 hr. Til slutt, hvis dårlig transduksjon er observert de nevnte faktorer som påvirker viral titer og størrelsesbegrensningen for innsatsen for den retroviral vektor bør vurderes. Effektiviteten av knockdown er svært avhengig av miRNA. Siden effektiviteten varierer med kombinasjoner av målgenet, og miRNA det er verdt å utføre en effektivitet skjermen for å identifisere de som egner seg best.Teknikken er begrenset til de epiteliale fenomener av organoid system. I fremtiden kan det være mulig å studere infeksiøse eller immunmedierte sykdommer gjennom ko-kultur av patogener eller rekonstituering med komponenter utledet fra immunsystemet, henholdsvis. Videre kan retrovirus kun bære innsatser av en relativt liten størrelse. Følgelig, naturlig forekommende regulatoriske regioner er å utelukkes, og dermed ekspresjonen av transgenet ikke kan etterligne den forden endogene genet. Som nevnt ovenfor, er den knockdown effektivitet avhengig av målgenet og miRNA. Hvis ingen miRNA med egnet knockdown effektivitet kan bli funnet det kan begrense bruken av teknikken for det bestemte målgenet.
Teoretisk organoids er kompatible med alle standardiserte manipulerende teknikker som benyttes for cellelinjer. Retroviral transduksjon var den første metoden for å bli rapportert til 4, og nylig BAC (bakterielt kunstig kromosom) -transgenesis har blitt tilgjengelig 5. Med en total generasjonstid på 2-3 uker, etter transfeksjon av viral plasmid inn i emballasjen cellelinje, det er betydelig raskere enn generering av et transgent (tg) mus. Ved å opprettholde in vivo krypt-villus-arkitektur mens inneholder stamceller så vel som alle differensierte celle linjer av intestinal epitelium, broer organoid kultursystemet gapet mellom tg dyr og tidligere brukte cellekultur.
<pclass = "jove_content"> Protokollen er beskrevet her gir en metode for å utføre fenotypeanalyser av endodermal epitel in vitro gjennom gevinst-og taps av funksjon studier. Dette gjør det mulig å ta opp fysiologisk relevante spørsmål i voksen stamcellebiologi, med et minimalt behov for tg mus. For eksempel kan den generasjonen av betingede knockout mus unngås ved å bruke organoids avledet fra nyfødte mutanter med perinatal dødelighet seks. Dessuten kan teknikken anvendes til å organoids avledet fra tidligere etablerte knockout mus for å studere rollen til paralogues ved å utføre ytterligere knockdown 7,8.Etter etablering av tynntarms organoids har tilpasning av det opprinnelige kultur-protokollen tillates dyrking av pankreas, lever, tykktarm og mage epitel 9-11. Videre har menneskelige tarm organoids og kreft organoids er avledet fra normale menneskelige biopsier, primær adenoma og tykktarmskreft biopsier 10. Den virale infeksjon protokollen kan lett utvides til disse typer organoids og gir en enestående måte å utføre funksjonelle studier i humane vev avledet.
Til sammen er retrovirale transduksjon av tynntarms organoids en verdifull ressurs for å undersøke stamcelle vedlikehold, differensiering og celle skjebne beslutning, samt cellesignalering og celle-celle interaksjoner.
The authors have nothing to disclose.
Koo BK og Mustata RC støttes av Sir Henry Dale Fellowship fra Wellcome Trust og Andersson-Rolf A er støttet av Medical Research Council (MRC). Fink J er støttet av Wellcome Trust 4-årig PhD-programmet.
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-034 | |
Glutamax 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
Hepes 1M | Invitrogen | 15630-056 | |
Penicillin- Streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
B27 supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
mouse EGF 500 µg/ml | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
mouse Noggin 100 µg/ml | Peprotech | 250-38 | |
R-Spondin conditioned medium | The conditioned media is generated from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 | ||
Wnt conditioned medium | The conditioned media is generated from L cells, for details see Sato and Clevers 2013 | ||
Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
Y-27632 10 µM | Sigma | Y0503-1MG | |
Polybrene 8 µg/ml) | Sigma | H9268-5G | |
Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) supplied by AMSBIO can be used as an alterntive. |
24 well plate | Greiner Bio One | 662960 | |
48 well plate | Greiner Bio One | 677980 | |
CHIR99021 | Sigma | A3734-1MG | |
Platinum- E cells | Cell biolabs | RV-102 | |
Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
Blasticidin | Invitrogen | A1113902 | |
Polyethyleneimine (PEI) | Polysciences | 23966 | |
opti-MEM | Life Technologies | 51985-034 | |
TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
4-OHT | Sigma | H7904 |