Выделение РНК от мыши поджелудочной железы: Рибонуклеаза богатых тканей
Summary
We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.
Abstract
Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.
Introduction
Выделение РНК с высокой целостности требуется для обычных экспериментов молекулярной биологии, таких как северной блоттинга 9 Qrt-ПЦР 1 или экспрессии генов профилирования 5. Большинство современных методов выделения РНК основаны на модификаций тиоцианата гуанидина протоколов 2, 3. Гуанидин тиоцианат является сильным белок денатурирующего и эффективно разрушают активность рибонуклеазы при большинстве условий. Популярный метод Chomczynski и Сакки 3 в сочетании фенола в гуанидинтиоцианата лизирующим раствором, сокращая время изоляции около 4 часов. Многие коммерчески доступные реагенты экстракции РНК основаны на Chomczynski и Sacchi метода 3.
Рибонуклеазы богатые ткани, такие как человека или мыши поджелудочной железы представляет собой дополнительную проблему для выделения РНК. Мышь поджелудочной железы может содержать до 75 мг рибонуклеазы 6 некоторые из которых выйдет Даринаг разрушение ткани поджелудочной железы, что приводит к ткани автолиза. Модификации протоколов гуанидинтиоцианата успешно используются для изоляции РНК из поджелудочной железы с высокой целостности 2, 4, 7, 10. Настой РНК стабилизации реагента в мышь поджелудочной железы способствовало изоляции РНК с высокой целостности 4, 7, 10, однако настой решения в поджелудочную железу требует большого мастерства, может потребоваться специализированные инструменты, такие как вскрытии микроскопом и нарушая архитектуру ткани во время процедуры может привести к лизису клеток. Перфузии ткани со стабилизацией РНК реагента может помешать с другими приложениями, включая изоляции белка и гистологического окрашивания. Кроме того, этот метод не подходит для выделения РНК из поджелудочной железы человека. Другие протоколы требуют подготовки конкретных решений следователем 2.
Мы сообщаем протокол для изоляции РНК с высокой целостности от мыши поджелудочной железы. Чтэ протокол использует элементы ранее опубликованных методов и в значительной степени основаны на стандартных фенол / гуанидинтиоцианата основе лизиса протоколов реагентов. Она не требует подготовки специализированных решений и не требует вливания реагентов в поджелудочную железу. Критические шаги для успешного выделения РНК включают высокую фенол / гуанидина на основе лизиса реагента соотношение тканей, удаления непереваренной ткани предварительного разделения фаз и включение ингибитора рибонуклеазы к полученному раствора РНК. Используя эти и другие модификации, мы обычно изолировать РНК с RIN больше, чем 7, который будет использоваться для рутинного анализа экспрессии генов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изоляция РНК из тканей, которые рибонуклеазы богатых представляет собой серьезную проблему для экспериментов молекулярной биологии. Различные Реагенты и наборы, которые коммерчески доступны, которые в основном основано на методе фенол гуанидин тиоцианат экстракции РНК. Гуанидин тио…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Цзяньхуа Линг, Раймонд Макдоналд, Galvin Свифт, Мишель Гриффин, Пол Grippo и Сатьянараяна Rachagani за их полезные комментарии, предложения и обмена протоколов к ним. Эта работа была поддержана грантом U01CA111294 и премию развития идея с Программой Государственного Университета Огайо Интрамурального Research.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Power Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | Homogenizer |
| 5424R | Eppendorf | Refrigerated microcentifuge | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596018 | Lysis reagent |
| Student Vannas spring scissors | Fisher | 91500-09 | use to cut pancreas from attached tissues |
| Surgical scissors, 6 inch | Fisher | 08-951-20 | use to cut scin of mouse |
| Blunt end forceps | Fisher | 1381239 | use to hold pancreas while dissecting |
| Isoflurane USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetic |
| Rnase out (40 U/µl) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | General Rnase inactivator |
| HPLC grade water | Fisher | W5-4 | For washing homogenizer blades |
| Molecular Biology grade water | Hyclone | SH30538.03 | Elution of RNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Purification Kit |
| 2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | 352099 | |
| 70% ethanol | Fisher | ||
| 100% ethanol | Fisher | ||
| 200 ul pipet tips | Rainin | GPL200F | For cleaning homogenizer blades |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Bioanalyzer | Agilent | Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity | |
| RNAlater | Ambion | RNA Stabilization Reagent | |
| RNeasy spin columns | Qiagen | spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit | |
| Mice | Chales River | strain C57BL/6 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
| Mice | Jackson Lab | strain 129 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
Riferimenti
- Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
- Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochimica. 18, 5294-5299 (1979).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas. Biotechniques. 52, 332-334 (2012).
- Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science. 283, 83-87 (1999).
- Lenstra, J. A., Beintema, J. J. The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases. European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40, 617-621 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. . RNA A Laboratory Manual. , (2011).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).
