عزل الحمض النووي الريبي من بنكرياس الفأر: A-ريبونوكلياز الأنسجة الغنية
Summary
We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.
Abstract
Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.
Introduction
مطلوب عزل الحمض النووي الريبي مع سلامة عالية للروتين تجارب البيولوجيا الجزيئية مثل شمال النشاف 9، QRT-PCR 1 أو التعبير الجيني التنميط 5. وتستند معظم الطرق المعاصرة لعزل الحمض النووي الريبي على إدخال تعديلات على البروتوكولات ثيوسيانات الجوانيدين 2، 3. الجوانيدين ثيوسيانات هو ممسخ بروتين قوي وفعال وتعطيل نشاط ريبونوكلياز في معظم الظروف. طريقة شعبية من Chomczynski وساكي 3 مجتمعة الفينول في حل الجوانيدين ثيوسيانات تحلل، مما يقلل من الوقت العزلة إلى حوالي 4 ساعة. وتقوم العديد من الكواشف المتاحة تجاريا استخراج الحمض النووي الريبي على Chomczynski وطريقة ساكي 3.
الأنسجة الغنية ريبونوكلياز مثل الإنسان أو الماوس البنكرياس يمثل تحديا إضافيا لعزل الحمض النووي الريبي. قد تحتوي الماوس البنكرياس تصل إلى 75 ملغ من ريبونوكلياز 6 سيصدر بعضها الزيتوز تعطيل الأنسجة البنكرياس مما يؤدي إلى انحلال ذاتي الأنسجة. وقد استخدمت التعديلات على البروتوكولات الجوانيدين ثيوسيانات بنجاح لعزل الحمض النووي الريبي من البنكرياس مع سلامة عالية 2، 4، 7، 10. التسريب من الحمض النووي الريبي لتحقيق الاستقرار في الماوس كاشف البنكرياس العزلة سهلت من الحمض النووي الريبي مع سلامة عالية 4، 7، 10، ولكن ضخ الحلول في البنكرياس يتطلب مهارة كبيرة، قد تتطلب أدوات متخصصة مثل مجهر تشريح وتعطيل العمارة الأنسجة أثناء إجراء قد يؤدي إلى تحلل الخلايا. Perfusing الأنسجة مع تثبيت الحمض النووي الريبي كاشف قد تتداخل مع غيرها من التطبيقات بما في ذلك عزل البروتين وتلطيخ النسيجية. علاوة على ذلك، هذه التقنية ليست مناسبة لعزل الحمض النووي الريبي من البنكرياس الإنسان. بروتوكولات أخرى تتطلب إعداد حلول محددة من قبل المحقق 2.
نفيدكم بروتوكول لعزل الحمض النووي الريبي مع سلامة عالية من الماوس البنكرياس. اليستخدم بروتوكول البريد عناصر الأساليب المنشورة سابقا، ويستند إلى حد كبير على الفينول / جوانيداين تحلل بروتوكولات كاشف القائم على ثيوسيانات القياسية. أنها لا تتطلب إعداد الحلول المتخصصة كما أنها لا تتطلب ضخ الكواشف في البنكرياس. وتشمل الخطوات الحاسمة لنجاح عزل الحمض النووي الريبي عالية الفينول / القائم جوانيداين تحلل كاشف إلى نسبة الأنسجة، وإزالة الأنسجة غير مهضوم قبل مرحلة الانفصال وإدراج المانع ريبونوكلياز إلى حل RNA الناتجة عن ذلك. باستخدام هذه التعديلات وغيرها، ونحن عادة عزل الحمض النووي الريبي مع رين أكبر من 7 لاستخدامها في تحليل التعبير الجيني الروتينية.
Protocol
Representative Results
Discussion
عزل الحمض النووي الريبي من الأنسجة التي يتم ريبونوكلياز الغنية يمثل تحديا كبيرا للتجارب البيولوجيا الجزيئية. والمتاحة تجاريا التي تستند الكواشف المختلفة ومجموعات في المقام الأول على طريقة الفينول الجوانيدين ثيوسيانات من استخراج الحمض النووي الريبي. الجوانيدين ثي…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جيان هوا لينغ، ريموند ماكدونالد، جالفين سويفت، ميشيل غريفين، بول Grippo وساتيانارايانا Rachagani الخاصة بهم مفيدة تعليقات واقتراحات وتبادل بروتوكولاتها. وأيد هذا العمل من قبل U01CA111294 منحة وجائزة تنمية فكرة من برنامج بحوث جماعية جامعة ولاية أوهايو.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Power Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | Homogenizer |
| 5424R | Eppendorf | Refrigerated microcentifuge | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596018 | Lysis reagent |
| Student Vannas spring scissors | Fisher | 91500-09 | use to cut pancreas from attached tissues |
| Surgical scissors, 6 inch | Fisher | 08-951-20 | use to cut scin of mouse |
| Blunt end forceps | Fisher | 1381239 | use to hold pancreas while dissecting |
| Isoflurane USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetic |
| Rnase out (40 U/µl) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | General Rnase inactivator |
| HPLC grade water | Fisher | W5-4 | For washing homogenizer blades |
| Molecular Biology grade water | Hyclone | SH30538.03 | Elution of RNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Purification Kit |
| 2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | 352099 | |
| 70% ethanol | Fisher | ||
| 100% ethanol | Fisher | ||
| 200 ul pipet tips | Rainin | GPL200F | For cleaning homogenizer blades |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Bioanalyzer | Agilent | Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity | |
| RNAlater | Ambion | RNA Stabilization Reagent | |
| RNeasy spin columns | Qiagen | spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit | |
| Mice | Chales River | strain C57BL/6 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
| Mice | Jackson Lab | strain 129 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
Riferimenti
- Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
- Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochimica. 18, 5294-5299 (1979).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas. Biotechniques. 52, 332-334 (2012).
- Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science. 283, 83-87 (1999).
- Lenstra, J. A., Beintema, J. J. The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases. European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40, 617-621 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. . RNA A Laboratory Manual. , (2011).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).
