माउस अग्न्याशय से शाही सेना अलगाव: एक ribonuclease युक्त ऊतक
Summary
We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.
Abstract
Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.
Introduction
उच्च निष्ठा के साथ शाही सेना के अलगाव ऐसे उत्तरी सोख्ता 9, QRT-पीसीआर 1 या 5 रूपरेखा जीन अभिव्यक्ति के रूप में नियमित आणविक जीव विज्ञान के प्रयोगों के लिए आवश्यक है. शाही सेना अलगाव की सबसे समकालीन तरीकों guanidine thiocyanate प्रोटोकॉल 2, के संशोधनों पर आधारित हैं 3. Guanidine thiocyanate एक मजबूत प्रोटीन विकृतिकरण करने वाला साधन है और प्रभावी रूप से सबसे परिस्थितियों में ribonuclease की गतिविधि को बाधित करेगा. Chomczynski और Sacchi 3 की लोकप्रिय विधि के बारे में 4 घंटे के लिए अलगाव समय को कम करने, guanidine thiocyanate lysis समाधान के लिए फिनोल संयुक्त. कई वाणिज्यिक उपलब्ध शाही सेना निकासी अभिकर्मकों Chomczynski और Sacchi विधि 3 पर आधारित हैं.
ऐसे मानव या माउस अग्न्याशय के रूप में ribonuclease अमीर ऊतकों शाही सेना को अलग करने के लिए एक अतिरिक्त चुनौती प्रस्तुत करता है. माउस अग्न्याशय, जिनमें से कुछ ड्यूरिन जारी किया जाएगा ribonuclease 6 की 75 मिलीग्राम शामिल कर सकते हैंजी ऊतक आत्म – विनाश में जिसके परिणामस्वरूप अग्नाशय के ऊतकों के विघटन. Guanidine thiocyanate प्रोटोकॉल के संशोधन सफलतापूर्वक उच्च अखंडता 2, 4, 7, 10 उच्च अखंडता 4, 7, 10 के साथ शाही सेना के माउस अग्न्याशय में मदद की अलगाव में शाही सेना स्थिरीकरण अभिकर्मक की. आसव, हालांकि निषेचन के साथ अग्न्याशय से शाही सेना को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है अग्न्याशय में समाधान, महान कौशल की आवश्यकता है इस तरह के एक विदारक माइक्रोस्कोप और प्रक्रिया के दौरान ऊतक वास्तुकला में खलल न डालें सेल में हो सकता है के रूप में विशेष उपकरणों की आवश्यकता हो सकती. आरएनए स्थिरीकरण अभिकर्मक के साथ ऊतक perfusing प्रोटीन अलगाव और ऊतकीय धुंधला सहित अन्य अनुप्रयोगों के साथ हस्तक्षेप कर सकता है. इसके अलावा, इस तकनीक को मानव अग्न्याशय से शाही सेना को अलग करने के लिए उपयुक्त नहीं है. अन्य प्रोटोकॉल अन्वेषक 2 द्वारा विशिष्ट समाधान की तैयारी की आवश्यकता होती है.
हम माउस अग्न्याशय से उच्च निष्ठा के साथ शाही सेना को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट. गुई प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित तरीकों के तत्वों का उपयोग करता है और बड़े पैमाने पर मानक फिनोल / guanidine thiocyanate आधारित सेल अभिकर्मक प्रोटोकॉल पर आधारित है. यह विशेष समाधान की तैयारी की आवश्यकता नहीं है और न ही यह अग्न्याशय में अभिकर्मकों के अर्क की आवश्यकता होती है. सफल शाही सेना अलगाव के लिए महत्वपूर्ण कदम ऊतक अनुपात, जिसके परिणामस्वरूप आरएनए समाधान के लिए जुदाई और एक ribonuclease अवरोध करनेवाला के शामिल किए जाने के चरण से पहले पचाया नहीं ऊतक को हटाने के लिए एक उच्च फिनोल / guanidine आधारित सेल अभिकर्मक शामिल हैं. इन और अन्य संशोधनों का उपयोग करना, हम आम तौर पर 7 से अधिक दिनचर्या जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए प्रयोग की जाने वाली Rin के साथ शाही सेना को अलग.
Protocol
Representative Results
Discussion
अमीर ribonuclease रहे हैं कि ऊतकों से शाही सेना को अलग आणविक जीव विज्ञान के प्रयोगों के लिए एक बड़ी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है. विभिन्न अभिकर्मकों और किट मुख्य रूप से शाही सेना निकासी की फिनोल guanidine thiocyanate विधि…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनके सहायक टिप्पणियां, सुझाव और उनके प्रोटोकॉल के बंटवारे के लिए Jianhua लिंग, रेमंड मैकडोनाल्ड, Galvin स्विफ्ट, मिशेल ग्रिफिन, पॉल Grippo और सत्यनारायण Rachagani धन्यवाद. इस काम अनुदान U01CA111294 और ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम से एक आइडिया विकास पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Power Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | Homogenizer |
| 5424R | Eppendorf | Refrigerated microcentifuge | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596018 | Lysis reagent |
| Student Vannas spring scissors | Fisher | 91500-09 | use to cut pancreas from attached tissues |
| Surgical scissors, 6 inch | Fisher | 08-951-20 | use to cut scin of mouse |
| Blunt end forceps | Fisher | 1381239 | use to hold pancreas while dissecting |
| Isoflurane USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetic |
| Rnase out (40 U/µl) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | General Rnase inactivator |
| HPLC grade water | Fisher | W5-4 | For washing homogenizer blades |
| Molecular Biology grade water | Hyclone | SH30538.03 | Elution of RNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Purification Kit |
| 2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | 352099 | |
| 70% ethanol | Fisher | ||
| 100% ethanol | Fisher | ||
| 200 ul pipet tips | Rainin | GPL200F | For cleaning homogenizer blades |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Bioanalyzer | Agilent | Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity | |
| RNAlater | Ambion | RNA Stabilization Reagent | |
| RNeasy spin columns | Qiagen | spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit | |
| Mice | Chales River | strain C57BL/6 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
| Mice | Jackson Lab | strain 129 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
Riferimenti
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