Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.
新型生物标志物的发现在提供更多的敏感性和特异性疾病检测至关重要的作用。不幸的是许多存在于生物流体中低丰度生物标记物不能容易地与质谱法或免疫测定法,因为它们存在于非常低的浓度,是不稳定的,并且往往是由高丰度蛋白质,如白蛋白或免疫球蛋白掩蔽检测。诱饵含聚(N-异丙基丙烯酰胺)(NIPAM)基于纳米颗粒是能够克服这些生理屏障。在一个步骤中,他们能够捕捉,集中和保持体液的生物标记物。低分子量的分析物进入所述纳米颗粒的核心,由不同的有机的化学染料,它作为高亲和力蛋白诱饵被捕获。该纳米颗粒可以由几个数量级集中感兴趣的蛋白质。这个浓度因子是足以增加蛋白质水平,使得蛋白质内的目前质谱仪,免疫印迹和免疫检测限。纳米颗粒可以一起孵育过多的生物体液和它们能够极大丰富的低分子量蛋白质和肽的浓度,同时排除白蛋白和其它高分子量的蛋白质。我们的数据表明,在特定分析物的浓度的10,000倍放大,可以实现,使质谱和免疫检测以前无法检测的生物标志物。
尽管完成了人类基因组测序,显著进展尚未作出确定的生物标志物预测的早期阶段的疾病,或与治疗结果,或预测1相关。其中一个原因缺乏进展是,很多潜在的生物标志物显著以低于传统质谱和其他生物标志物发现平台的检测极限浓度存在。质谱(MS)和多反应监测(MRM)具有典型的检测灵敏度大于50纳克/毫升,而在50 pg / ml和10毫微克/毫升在临床实验室下降了免疫测定的范围广大的分析物的。这意味着许多生物标志物,特别是在疾病的早期阶段无法通过常规的MS和MRM 2被检测到。除了高丰度蛋白质,如白蛋白和免疫球蛋白的复合物的生物流体的存在往往掩盖由十亿倍货存ESS的低丰度,低分子量蛋白质和肽3,4。为此几个样品的准备步骤之前所需要质谱测序和鉴定。一个这样的预备步骤中采用的高丰度蛋白质的与市售的耗尽列5-8的耗尽。不幸的是这一步骤导致候选生物标志物的产率的降低,因为它们通常是非共价地与该被除去的载体蛋白相关联。另一个挑战是候选生物标志物前体的稳定性表示,一旦样品的采集。蛋白质是发生降解内源性或外源性蛋白酶9。水凝胶的纳米颗粒可以通过扩增推定的生物标志物的浓度,以测定的范围内的电平超越这些关键的挑战,同时保护蛋白免受降解10-13。
要注意个很重要在LMW在血液中的蛋白质是小完整蛋白质以及大蛋白的片段的混合物。组织来源的蛋白质比60 kDa的较大的过大而不能穿过血管基底膜被动地进入血流,但它们可以在血液中作为肽或蛋白质片段14来表示。我们的目标是测量新颖循环生物标志物,可以是候选疾病的早期发现,患者分层为治疗,并监测对治疗的反应。在创建了纳米颗粒选择性地排除高丰度的免疫球蛋白和白蛋白,同时捕获较小的蛋白质和肽,并根据初始体积上集中起来,以100倍。
我们的团队确定了一套小的有机染料,可成功地用作高亲和力的分子饵料蛋白质和多肽。蛋白质 – 染料的结合被认为是由于疏水性和静电相互作用的结合第对染料的芳环交织经由蛋白质上的表面11的疏水口袋的蛋白质。
的毒饵,这取决于它们的化学性质,表现出分析物的选择的类的特定亲和力。诱饵与载体蛋白竞争,如白蛋白,用于蛋白质或肽。低分子量蛋白/肽被截留在颗粒中。高分子量的蛋白质,如白蛋白和球蛋白是从进入的,因为筛分能力的粒子可防止因水凝胶11(图1)的限制孔。
水凝胶粒子是通过由过硫酸铵11开始沉淀聚合合成。异丙基丙烯酰胺(NIPAM),丙烯酸(AAC)和烯丙基胺(AA)和交联剂N,N'-亚甲基双(BIS)的共聚单体被允许在70℃下反应6小时,在稀释条件11,13。聚的高蛋白结合亲和性(N-异丙基丙烯酰胺-共聚-丙烯酸)(聚(NIPAM-CO-AAC)nanoparticlesis通过共价掺入含氨基的染料( 即 ,sulfonatedanthraquinonetriazine染料)在纳米粒子,通过实现在这取决于染料的亲水/疏水特性的水性或有机溶剂中进行的酰胺化反应如图11所示,用一个anthraquinonetriazine染料的氯原子在纳米颗粒中的胺基团的13。亲核取代被用于创建聚含染料(NIPAM -共聚-丙烯胺)(AA)的纳米颗粒11,12。的两步聚合方法被用来创建含有乙烯基磺酸(VSA)11,13的外壳的水凝胶粒子。
水凝胶纳米粒子可用于各种生物流体,包括全血,血浆,血清,脑脊液,汗液,尿等。在一个步骤中,在溶液中,nanoparticles进行快速(几分钟内)封存和低分子量的分析物浓度10,11,13,15-18。蛋白质随后从纳米颗粒洗脱和检测用蛋白质印迹19-21,质谱法10,11,13,15,18,22,23,免疫/ ELISA 10,11,15,18,或反相蛋白质微阵列16, 24测定。纳米功能化化学饵料,并提出核或核 – 壳结构,捕捉和集中的基础上饵/壳的物理化学性质的蛋白质。因此,掺入纳米颗粒不同的染料将捕获的蛋白质的不同亚群具有不同的基础上,染料亲和效率,溶液的pH,并且存在/不存在竞争的高丰度蛋白13。此外,纳米颗粒的相对量,以将溶液的体积将影响从纳米颗粒中的蛋白质的产率。这些方面水凝胶的纳米粒子的收获是使用三种不同的纳米颗粒饵收割蛋白是由含有高含量的蛋白质的血浆样品显示出,并从尿样品通常不包含大量的蛋白质。在这个协议中,我们证明收获和浓缩使用聚(NIPAM-CO-的AAc),聚(NIPAM /染料),以及核 – 壳纳米颗粒的血浆样品的肿瘤坏死因子α(TNFα)(聚(NIPAM-CO-VSA)) 。聚(NIPAM /染料)的纳米颗粒被示为集中于加入人尿样品分枝杆菌抗原,以模仿结核分枝杆菌感染的个体。
临床意义
血清或血浆样品被认为含有低丰度循环的蛋白质和多肽可提供的信息有关的生物体作为一个整体的国家的丰富来源。尽管血清蛋白质组学的承诺,有三个基本的和严重的生理障碍,阻碍生物标志物的发现和翻译临床获益10,11,16,25。
一,重要诊断标志物可能存在于非常低丰度(浓度)在血液中。早期病变组织,例如预转?…
The authors have nothing to disclose.
迈克尔·亨利,都柏林城市大学,请协助与图5所示的数据收集和分析,这项工作得到了部分支持(1)乔治·梅森大学,(2)意大利IstitutoSuperiore二SANITA“在意大利/美国框架健康的乔治·梅森大学的美国能源部和人类服务部,以及公共卫生意大利外交部,(3)美国国立卫生研究院,IMAT计划资助1R21CA137706-01和1R33CA173359-01对上湖人,以及(4)谷神星纳米科学公司之间的合作协议。
hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
Tris HCl, 50mM pH7.0 | VWR | IC816116 | 50mM, pH 7 |
Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | available from VWR |
Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
sodium thiocyanate 25mM | Acros Organics | 419675000 | for serum/plasma samples |
Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | for urine samples |
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | use at room temperature to prevent SDS from precipitating |
Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | do not substitute a boiling water bath |
Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | for serum/plasma samples |
Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50ml tube capacity, rcf 3700 x g |
Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
50ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | with screw caps for urine samples |
1.5ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
Disposable plastic transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | at least 1ml capacity |
Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
Timer | Fisher Scientific | S04782 | seconds/minutes |