The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.
En væsentlig del af post-fosterudvikling hos bananfluen, Drosophila melanogaster, finder sted inden for et sæt af SAC-lignende strukturer, der kaldes fantasiens diske. Disse diske giver anledning til en høj procentdel af voksne strukturer, der findes inden den voksne flue. Her beskriver vi en protokol, der er optimeret til at inddrive disse diske og forberede dem til analyse med antistoffer, transkriptionale reportere og protein fælder. Denne procedure er bedst egnet til tynde væv som imaginal discs, men kan let modificeres til anvendelse med tykkere væv, såsom larve hjerne og voksen æggestok. Den skriftlige protokol og tilhørende video vil guide læseren / seeren gennem dissektion af tredje stadie larver, fiksering af væv, og behandling af fantasiens diske med antistoffer. Protokollen kan bruges til at dissekere imaginære diske fra yngre første og andet stadium larver samt. Fordelen ved dette er, at den er forholdsvis kort, og det har væreOr optimeret til høje konservering af det dissekerede væv kvalitet. En anden fordel er, at fiksering procedure, der anvendes fungerer godt med det overvældende antal af antistoffer, der genkender Drosophila-proteiner. Det er vores erfaring, at der er et meget lille antal følsomme antistoffer, der ikke fungerer godt med denne procedure. I disse situationer synes middel til at være at bruge en alternativ fiksering cocktail samtidig med at følge de retningslinjer, som vi har angivet for dissektion trin og antistofinkubationer.
For mere end et århundrede bananfluen, Drosophila melanogaster, har været en førende system til at studere udvikling, adfærd og fysiologi. Udvikling i fluen kan inddeles i to brede faser: embryonale og post-embryonale med meget af den sidstnævnte finder sted i monolag epiteler kaldet fantasiens diske 1-3. Tegninger af fantasiens diske blev først udgivet i 1864 af August Weismann som en del af hans brede monografi om insekt udvikling 1. Disse diske begynder deres udvikling under embryogenese, er mønstret i de larvestadier, overleve den massive histolysis af de tidlige puppe stadier, og i sidste ende føre til en høj procentdel af voksne strukturer, der findes inden den voksne flyve 1-14. Under larveudvikling hver disk gør flere kritiske beslutninger om skæbne, form og størrelse. Inden for de første og anden larvernes instars er skiverne opgave at vedtage en primær skæbne, establishing Rumopdelinger vedtagelse den rigtige form og skabe det nødvendige antal celler 15-16. I løbet af tredje larve stadie og tidlig præ-puppestadiet, fantasiens diske fortsat at dele og mønstrede som celler vedtager deres terminale skæbner 16.
Under den tidlige historie Drosophila udviklingsmæssige biologi blev fantasiens diske studeret næsten udelukkende i forbindelse med en normal udvikling og i de begrænsede tilfælde, hvor et tab eller gevinst af funktion mutanten var levedygtig. Brugen af røntgenstråler til at inducere mitotisk rekombination tilladt for letale mutationer, der skal analyseres i cellekloner i larvestadiet og voksne væv. Denne metode er blevet forbedret ved indførelse af transgene metoder til at analysere tab og få af funktion-mutationer i både larvernes og voksne væv. Antallet af antistoffer, transkriptionale reportere og proteinholdigt lokkemiddel til at beskrive den molekylære landskab af vildtype og mutant væv er også constgelige vokser. Ved hjælp af disse molekylære markører til at analysere tab og få af funktion mutant cellekloner har gjort det stadig muligt at opnå en real-time forståelse af, hvordan mutantceller afvige fra deres vildtype fætre under udviklingen. Til korrekt at drage fordel af disse værktøjer og reagenser er det afgørende at have præparater af fantasiens diske, der kan ses, fotograferet og analyseret af høj kvalitet. Målet med dette manuskript er at give en optimeret protokol til isolering og forberedelse af øje-antennal disk-kompleks (figur 1A). Det kan også med held anvendes til at isolere en lang række yderligere diske, herunder dem, der giver anledning til vinger, halteres, T1-T3 ben og kønsorganerne (Figur 1B-E). Denne procedure, med mindre modifikationer, er blevet anvendt til at isolere imaginære diske fra Drosophila i næsten 80 år.
Som beskrevet ovenfor, eftersom de fleste gener udtrykkes i multiple udviklingsstadier og i et væld af væv, er det ofte umuligt at undersøge de virkninger, som nulmutanter har på hele øjet som dyret dør længe før tredje stadie larvestadiet. Fire metoder har gjort undersøgelse af mere udviklede væv, såsom nethinden betydeligt mere medgørlige. Den første er Flippase (FLP) / Flippase rekombination Target (FRT) fremgangsmåde til generering af mutante cellekloner i en ellers vildtype væv 17-19. I dette tilfælde mutant væv identificeres ved fraværet af en visuel markør, såsom grønt fluorescerende protein (GFP) og kan sammenlignes med det omgivende vildtype væv, hvori GFP er til stede (figur 2D). Den anden er "FLP-out" metode, hvor et transgen udtrykkes i en population af celler 20. I dette tilfælde de cellekloner identificeret ved tilstedeværelsen af GFP og i forhold til det omgivende vildtype væv, der mangler GFP reporter (figur2E). Den tredje er den mosaiske Analyse med en repressibel cellemarkør (MARCM) teknik, der kombinerer elementer af FLP / FRT mutant klon og FLP-out ekspressionssystemer 21. Med denne metode et transgen kan udtrykkes i en population af celler, som samtidig er mutant for et enkelt genetisk locus. Ligesom FLP-ud kloner er MARCM kloner identificeres ved tilstedeværelsen af GFP og i forhold til det omgivende vildtype væv, der mangler GFP markør (figur 2F). Og endelig kan de gener og RNAi konstruktioner udtrykkes indenfor fantasiens væv under kontrol af specifikke promotor-GAL4 konstruktioner. Disse fire metoder har øget interessen for at studere fantasiens diske siden mutant eller overekspression kloner eller mønstre kan direkte sammenlignes med tilstødende vildtype væv. Beskrevet i denne procedure metode er udviklet således, at forskere, der studerer den post-embryonale udvikling af voksent væv i Drosophila,især dem, der stammer fra øjet-antennal disk, vil være i stand til at opnå væv af høj kvalitet til analyse. Selv om de enkelte forskere har lavet mindre ændringer, er kernen i denne procedure (som vi beskriver her) forblev stort set uændret. Da opnåelse af væv af høj kvalitet er afgørende for studiet af fantasiens diske vi håber denne skriftlige protokol og tilhørende video vil fungere som en værdifuld ressource i undervisningen.
Selv om denne fremgangsmåde i høj grad har fokuseret på isolation og efterfølgende behandling af øjet-antennal diske, er det muligt at foretage en bruges til at isolere og analysere fløj, haltere, ben og genitale diske (Figur 4). Den eneste nødvendige ændring af protokollen for at isolere disse diske (i modsætning til den øje-antennal disk) er metoden for grov dissektion (afsnit 2 i protokollen). Den første thorax ben (T1) par er fundet ved den forreste af larve og kan udvindes ved at følge …
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Anders Ready og Kevin Moses til undervisning JPK den oprindelige fantasiens disk dissektion procedure. Vi takker også Bonnie Weasner for genital disk i figur 1B og øjet disken i figur 2A, Brandon Weasner til figur 3, Bloomington Drosophila Stock Center for flyve pletter og Developmental Studies Hybridom Bank for antistoffer. CMS er blevet støttet af et stipendium fra National Institutes of Health (NIH) GCMS Training Grant (T32-GM007757), Frank W. Putnam Research Fellowship, og Robert Briggs Research Fellowship. JPK er støttet af en bevilling fra National Eye Institute (R01 EY014863)
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Used to create base for dissection plate |
Pryex Glass Petri Dish 150x20mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
#5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
9 well watch glass | Vairous Vendors | N/A | Used for fixation of imaginal disc complexes |
50ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | N/A | |
Small Stir Bar | Various Vendors | N/A | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask |
50ml Conical Tubes | Various Vendors | N/A | |
1.5ml Microfuge Tubes | Various Vendors | N/A | Clear or Dark depending upon application |
Microfuge Rack | Various Vendors | N/A | |
Benchtop Rotator | Various Vendors | N/A | 100ul volume should not splatter at low setting |
Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
100% Normal Goat Serum` | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
Primary Antibodies | Various Vendors | N/A | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer |
Seondary Antibodies | Various Vendors | N/A | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer |
Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
Glass Cover Slips 18x18mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
Kimwipe Tissue | Various Vendors | NA | Prevents Glass slides from adhering to silicone base |
Panit Brush 000 | Various Vendors | NA | Use to gently lower coverslip on to samples |