The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.
Een aanzienlijk deel van de post-embryonale ontwikkeling in de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, plaatsvindt binnen een set van sac-achtige structuren, genaamd imaginaire schijven. Deze schijven leiden tot een hoog percentage volwassen structuren die worden gevonden in de volwassen vlieg. Hier een protocol dat is geoptimaliseerd om deze schijven te herstellen en hen voor te bereiden voor analyse met antilichamen, transcriptie verslaggevers en eiwit valkuilen beschrijven we. Deze procedure is vooral geschikt voor dunne weefsels zoals imaginal schijven, maar kan eenvoudig worden aangepast voor gebruik met dikkere weefsels zoals de hersenen larven en volwassen eierstok. Het schriftelijk protocol en bijbehorende video zal de lezer / kijker te begeleiden bij de dissectie van derde instar larven, fixatie van het weefsel, en de behandeling van imaginaire schijven met antilichamen. Het protocol kan worden gebruikt om imaginal discs ontleden van larven jonger eerste en tweede instar ook. Het voordeel van dit protocol is dat het relatief kort en heeft zijnen geoptimaliseerd voor de hoge kwaliteit behoud van ontleed weefsel. Een ander voordeel is dat de fixatie procedure die wordt toegepast werkt goed met het overgrote aantal antilichamen dat Drosophila eiwitten herkennen. In onze ervaring, is er een zeer klein aantal gevoelige antilichamen die niet goed werken met deze procedure. In deze situaties, lijkt de oplossing te zijn om een alternatieve fixatie cocktail te gebruiken terwijl u de richtlijnen die wij hebben toegelicht voor de dissectie stappen en antilichaam incubatie volgen.
Al meer dan een eeuw de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, is een van de beste systeem om de ontwikkeling, het gedrag en de fysiologie te bestuderen geweest. Ontwikkeling in de vlieg kan worden onderverdeeld in twee grote fasen: de embryonale en post-embryonale met veel van deze laatste hebben binnen monolaag epithelia genoemd imaginaire schijven 1-3. Tekeningen van imaginaire schijven werden voor het eerst gepubliceerd in 1864 door August Weismann, als onderdeel van zijn brede monografie over insecten ontwikkeling 1. Deze schijven beginnen hun ontwikkeling tijdens de embryogenese, worden gevormd tijdens de larvale stadia, overleef de massale histolysis van de vroege stadia popstadium en uiteindelijk leiden tot een hoog percentage volwassen structuren die binnen de volwassen vliegen 1-14. Tijdens de ontwikkeling van de larven elke schijf maakt een aantal belangrijke beslissingen met betrekking tot het lot, vorm en grootte. Binnen de eerste en tweede larvale stadia, worden de schijven belast met de vaststelling van een primaire lot, establishing compartiment grenzen, de vaststelling van de juiste vorm en het genereren van de benodigde aantal cellen 15-16. Tijdens het derde larvale instar en vroege pre-popstadium, de imaginaire schijven blijven delen en zijn patroon als cellen hun terminal lot 16 vast te stellen.
Tijdens de vroege geschiedenis van Drosophila ontwikkelingsbiologie, werden imaginal schijven vrijwel uitsluitend onderzocht in het kader van de normale ontwikkeling en in de beperkte gevallen waarin een verlies of winst-of-function mutant levensvatbaar was. Het gebruik van X-stralen induceren mitotische recombinatie toegestaan letale mutaties in celklonen binnen de larven en volwassen weefsels te analyseren. Deze werkwijze is verbeterd door de introductie van transgene methoden verlies analyseren en gain-of-function mutaties in zowel larven en volwassen weefsels. Het aantal antilichamen, transcriptie verslaggevers en eiwit vallen voor het beschrijven van de moleculaire landschap van wild-type en mutante weefsels is ook constantly groeien. Met deze moleculaire merkers verlies analyseren en gain-of-function mutante celklonen is het steeds mogelijk om een real-time begrijpen hoe mutantcellen afwijken van hun wildtype neven tijdens ontwikkeling krijgen. Om goed gebruik maken van deze instrumenten en reagentia is het essentieel om een hoge kwaliteit van de voorbereidingen imaginal schijven die kunnen worden bekeken, gefotografeerd en geanalyseerd hebben. Het doel van dit manuscript is een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie en de voorbereiding van de eye-antennaal schijf complex (Figuur 1A) te verstrekken. Het kan ook met succes worden gebruikt om een groot aantal extra schijven zoals die welke tot de vleugels, halters, T1-T3 benen en genitaliën (Figuur 1B-E) te isoleren. Deze procedure, met kleine aanpassingen is gebruikt om imaginal discs isoleren van Drosophila bijna tachtig jaren.
Zoals hierboven beschreven, aangezien de meeste genen die tijdens multiple ontwikkelingsstadia en in een veelheid van weefsels, is het vaak onmogelijk om de effecten te onderzoeken die null-mutanten op het hele oog als het dier sterft ruim voor het derde instar larvale stadium. Vier methoden hebben de studie van de meer ontwikkelde weefsels gemaakt, zoals het netvlies significant meer handelbaar. De eerste is de methode flippase (FLP) / flippase Recombinatie Target (FRT) genereren mutante cel klonen in een overigens wildtype weefsel 17-19. In dit geval de mutant weefsel wordt geïdentificeerd door de afwezigheid van een markering zoals Green Fluorescent Protein (GFP) en kan worden vergeleken met de omringende wildtype weefsel waarin GFP aanwezig is (figuur 2D). De tweede is de "FLP-out" werkwijze waarbij een transgen tot expressie wordt gebracht in een populatie van cellen 20. In dit geval de cel klonen worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van GFP en vergeleken met de omringende wildtype weefsel dat de GFP reporter mist (figuur2E). De derde is de Mosaic-analyse met een onderdrukbare Cell Marker (MARCM) techniek, die elementen van de FLP / FRT mutant kloon en FLP-out expressie systemen 21 combineert. Met deze methode een transgen kan worden uitgedrukt in een populatie van cellen die tegelijkertijd mutant voor individuele genetische locus. Like flp-out klonen worden MARCM klonen geïdentificeerd door de aanwezigheid van GFP en vergeleken met de omringende wildtype weefsel dat de GFP merker (figuur 2F) mist. Tenslotte, de genen en RNAi constructen kunnen worden die binnen imaginaire weefsels onder controle van promotor-GAL4 constructen. Deze vier methoden hebben de belangstelling voor het bestuderen denkbeeldige schijven toegenomen sinds mutant en overexpressie klonen of direct kunnen worden vergeleken met aangrenzende wildtype weefsel. Werkwijze in deze procedure wordt beschreven is ontwikkeld om onderzoekers die de post-embryonale ontwikkeling van volwassen weefsels in Drosophila bestuderenname afkomstig uit de oog-antennaal disc, kunnen hoge kwaliteit weefsel te verkrijgen voor analyse. Hoewel individuele onderzoekers lichte wijzigingen hebben gemaakt, heeft de kern van deze procedure (die we hier beschrijven) grotendeels onveranderd gebleven. Na het behalen van hoge kwaliteit weefsel is van cruciaal belang voor de studie van de imaginaire schijven we hopen dat dit schriftelijk protocol en de bijbehorende video zal dienen als een waardevol leermiddel.
Hoewel deze procedure is grotendeels gericht op de isolatie en daaropvolgende behandeling van oog-antennaal discs, het gemakkelijk kan worden gebruikt voor het isoleren en analyseren van de vleugel, haltere, been en genitale discs (figuur 4). De enige vereiste wijziging van het protocol voor het isoleren van deze schijven (in tegenstelling tot de eye-antennal disc) is de methode van grove dissectie (deel 2 van het protocol). De eerste thoracale been (T1) pair is te vinden op de voorste van de larve en k…
The authors have nothing to disclose.
We willen graag Donald Ready en Kevin Mozes bedanken voor het onderwijzen van JPK de originele imaginale schijf dissectie procedure. We danken ook Bonnie Weasner voor de genitale schijf in Figuur 1B en het oog schijf in figuur 2A, Brandon Weasner voor Figuur 3, de Bloomington Drosophila Stock Center for fly vlekken en de Developmental Studies Hybridoma Bank voor antilichamen. CMS is ondersteund door een toelage van de National Institutes of Health (NIH) GCMS Training Grant (T32-GM007757), de Frank W. Putnam Research Fellowship, en de Robert Briggs Research Fellowship. JPK wordt ondersteund door een subsidie van de National Eye Institute (R01 EY014863)
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Used to create base for dissection plate |
Pryex Glass Petri Dish 150x20mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
#5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
9 well watch glass | Vairous Vendors | N/A | Used for fixation of imaginal disc complexes |
50ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | N/A | |
Small Stir Bar | Various Vendors | N/A | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask |
50ml Conical Tubes | Various Vendors | N/A | |
1.5ml Microfuge Tubes | Various Vendors | N/A | Clear or Dark depending upon application |
Microfuge Rack | Various Vendors | N/A | |
Benchtop Rotator | Various Vendors | N/A | 100ul volume should not splatter at low setting |
Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
100% Normal Goat Serum` | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
Primary Antibodies | Various Vendors | N/A | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer |
Seondary Antibodies | Various Vendors | N/A | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer |
Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
Glass Cover Slips 18x18mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
Kimwipe Tissue | Various Vendors | NA | Prevents Glass slides from adhering to silicone base |
Panit Brush 000 | Various Vendors | NA | Use to gently lower coverslip on to samples |