विच्छेदन और imaginal डिस्क के immunostaining से<em> ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em
Summary
The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.
Abstract
के बाद भ्रूण फल मक्खी में विकास, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर का एक महत्वपूर्ण भाग, imaginal डिस्क कहा जाता थैली संरचनाओं की तरह का एक सेट के भीतर जगह लेता है. इन डिस्क्स वयस्क मक्खी के भीतर पाए जाते हैं कि वयस्क संरचनाओं के एक उच्च प्रतिशत को जन्म दे. यहाँ हम इन डिस्क की वसूली और एंटीबॉडी, ट्रांसक्रिप्शनल पत्रकारों और प्रोटीन जाल के साथ विश्लेषण के लिए उन्हें तैयार करने के लिए अनुकूलित किया गया है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन. यह प्रक्रिया सबसे अच्छा imaginal डिस्क की तरह पतली ऊतकों के लिए अनुकूल है, लेकिन आसानी से ऐसे लार्वा मस्तिष्क और वयस्क अंडाशय के रूप में मोटा ऊतकों के साथ उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है. लिखित प्रोटोकॉल और साथ वीडियो तीसरे instar लार्वा, ऊतक का निर्धारण, और एंटीबॉडी के साथ imaginal डिस्क के उपचार के विच्छेदन के माध्यम से पाठक / दर्शक मार्गदर्शन करेंगे. प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से युवा पहली और दूसरी instar लार्वा से imaginal डिस्क टुकड़े करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल का लाभ यह अपेक्षाकृत कम है और यह हो गया हैविच्छेदित ऊतक की उच्च गुणवत्ता के संरक्षण के लिए अनुकूलित एन. एक और लाभ कार्यरत है कि निर्धारण प्रक्रिया ड्रोसोफिला प्रोटीन समझते हैं कि एंटीबॉडी की भारी संख्या के साथ अच्छी तरह से काम करता है. हमारे अनुभव में, इस प्रक्रिया के साथ अच्छी तरह से काम नहीं करते कि संवेदनशील एंटीबॉडी की एक बहुत छोटी संख्या है. इन स्थितियों में, उपाय हम विच्छेदन कदम और एंटीबॉडी incubations के लिए उल्लिखित है कि दिशा निर्देशों का पालन करने के लिए जारी करते हुए एक वैकल्पिक निर्धारण कॉकटेल उपयोग करने के लिए प्रतीत होता है.
Introduction
अधिक से अधिक एक सदी फल मक्खी, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के लिए, विकास, व्यवहार और शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक प्रमुख प्रणाली रही है. उत्तरार्द्ध जगह लेने के ज्यादा के साथ भ्रूण और बाद भ्रूण monolayer epithelia भीतर imaginal डिस्क 1-3 बुलाया: मक्खी में विकास दो व्यापक चरणों में विभाजित किया जा सकता है. Imaginal डिस्क का चित्र पहली कीट विकास 1 पर उसकी व्यापक मोनोग्राफ का हिस्सा के रूप में अगस्त Weismann द्वारा 1864 में प्रकाशित किए गए थे. इन डिस्क्स 1-14 उड़ वयस्क के भीतर पाए जाते हैं कि वयस्क संरचनाओं के एक उच्च प्रतिशत को जन्म दे अंततः जल्दी पोटा संबंधी चरणों का भारी histolysis जीवित है, और, लार्वा चरणों के दौरान नमूनों हैं, embryogenesis दौरान उनके विकास शुरू करते हैं. लार्वा के विकास के दौरान प्रत्येक डिस्क भाग्य, आकृति और आकार के बारे में कई महत्वपूर्ण निर्णय करता है. पहले और दूसरे लार्वा instars भीतर, डिस्क, एक प्राथमिक भाग्य को गोद लेने के साथ स्थापित किया गया काम सौंपासही आकार को गोद लेने और कोशिकाओं 15-16 की अपेक्षित संख्या पैदा करने, डिब्बे सीमाओं hing. तीसरे लार्वा instar और जल्दी पूर्व पोटा संबंधी चरण के दौरान, imaginal डिस्क को विभाजित करने के लिए जारी है और कोशिकाओं उनके टर्मिनल भाग्य 16 अपनाने के रूप में नमूनों हैं.
ड्रोसोफिला विकासात्मक जीव विज्ञान के शुरुआती इतिहास के दौरान, imaginal डिस्क सामान्य विकास के संदर्भ में और एक हानि या लाभ के समारोह उत्परिवर्ती व्यवहार्य था जिसमें सीमित मामलों में लगभग विशेष रूप से अध्ययन किया गया. एक्स रे का उपयोग घातक म्यूटेशन के लिए अनुमति दी mitotic पुनर्संयोजन लार्वा और वयस्क ऊतकों के भीतर सेल क्लोन में विश्लेषण किया प्रेरित करने के लिए. इस विधि लार्वा और वयस्क ऊतकों दोनों में म्यूटेशन नुकसान का विश्लेषण और लाभ के समारोह के लिए ट्रांसजेनिक विधियों के लागू होने से सुधार किया गया है. जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती ऊतकों की आणविक परिदृश्य वर्णन करने के लिए एंटीबॉडी, ट्रांसक्रिप्शनल पत्रकारों और प्रोटीन जाल की संख्या भी const हैantly बढ़ रहा है. उत्परिवर्ती सेल क्लोन नुकसान का विश्लेषण और लाभ के समारोह के लिए इन आणविक मार्कर का उपयोग यह तेजी संभव उत्परिवर्ती कोशिकाओं के विकास के दौरान उनके जंगली प्रकार चचेरे भाई से विचलित कैसे की एक वास्तविक समय समझ हासिल करने के लिए बनाया गया है. ठीक से इन उपकरणों और अभिकर्मकों का लाभ लेने के लिए, देखी फोटो खिंचवाने और विश्लेषण किया जा सकता है कि imaginal डिस्क की उच्च गुणवत्ता की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण है. इस पांडुलिपि के लक्ष्य आंख antennal डिस्क जटिल (चित्रा 1 ए) के अलगाव और तैयारी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करना है. यह भी सफलतापूर्वक पंख, halteres, T1-T3 पैर और जननांगों (चित्रा 1 बी ई) को जन्म दे कि उन सहित अतिरिक्त डिस्क की एक विस्तृत विविधता को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मामूली संशोधनों के साथ यह प्रक्रिया लगभग अस्सी साल के लिए ड्रोसोफिला से imaginal डिस्क को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
सबसे जीन म्यू दौरान व्यक्त कर रहे हैं क्योंकि जैसा कि ऊपर वर्णित है,विकास की और ऊतकों की एक भीड़ में चरणों LTIPLE, यह पशु तीसरे instar लार्वा चरण से पहले अच्छी तरह से मर जाता है के रूप में अशक्त म्यूटेंट पूरी आँख पर है कि प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अक्सर असंभव है. चार विधियों ऐसे काफी अधिक विनयशील रेटिना के रूप में और अधिक विकसित ऊतकों का अध्ययन किया है. पहले एक अन्यथा जंगली प्रकार के ऊतकों 17-19 के भीतर उत्परिवर्ती सेल क्लोन पैदा करने की Flippase (FLP) / Flippase पुनर्संयोजन लक्ष्य (FRT) विधि है. इस उदाहरण में उत्परिवर्ती ऊतक ऐसे ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के रूप में एक दृश्य मार्कर के अभाव द्वारा की पहचान की है और GFP मौजूद है जिसमें आसपास के जंगली प्रकार के ऊतकों (चित्रा 2 डी) की तुलना में किया जा सकता है. दूसरा एक transgene कोशिकाओं 20 की आबादी में व्यक्त किया जाता है, जिसमें "FLP आउट" विधि है. इस उदाहरण में सेल क्लोन GFP संवाददाता का अभाव है कि आसपास के जंगली प्रकार के ऊतकों (चित्रा को GFP की उपस्थिति से पहचान और तुलना कर रहे हैं2 ई). तीसरे FLP / FRT उत्परिवर्ती क्लोन और FLP आउट अभिव्यक्ति सिस्टम 21 के तत्वों को जोड़ती है जो एक Repressible सेल मार्कर (MARCM) तकनीक, साथ मोजाइक विश्लेषण है. इस विधि के साथ एक transgene एक साथ एक व्यक्ति आनुवंशिक लोकस के लिए उत्परिवर्ती हैं कि कोशिकाओं की आबादी के भीतर व्यक्त किया जा सकता है. FLP आउट क्लोन की तरह, MARCM क्लोन GFP की उपस्थिति से पहचान और GFP मार्कर (चित्रा 2 एफ) का अभाव है कि आसपास के जंगली प्रकार के ऊतकों की तुलना में कर रहे हैं. और अंत में, जीन और आरएनएआई निर्माणों विशिष्ट प्रमोटर-GAL4 निर्माणों के नियंत्रण में imaginal ऊतकों के भीतर व्यक्त किया जा सकता है. उत्परिवर्ती या अधिक अभिव्यक्ति क्लोन या पैटर्न सीधे सटे जंगली प्रकार के ऊतकों की तुलना में किया जा सकता है के बाद से इन चार तरीकों imaginal डिस्क अध्ययन में रुचि बढ़ गई है. इस प्रक्रिया में वर्णित विधि विकसित किया गया है कि ताकि ड्रोसोफिला में वयस्क ऊतकों के बाद भ्रूण के विकास का अध्ययन करने वाले शोधकर्ताओं,विशेष रूप से आंख antennal डिस्क से व्युत्पन्न उन, विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक प्राप्त करने में सक्षम हो जाएगा. व्यक्तिगत शोधकर्ताओं मामूली संशोधन किए गए हैं, इस प्रक्रिया (हम यहाँ का वर्णन है) के कोर काफी हद तक अनछुए रह गया है. उच्च गुणवत्ता ऊतक प्राप्त हम यह लिखा प्रोटोकॉल और साथ वीडियो एक मूल्यवान शिक्षण संसाधन के रूप में काम करेगा आशा imaginal डिस्क के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है के बाद से.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रक्रिया काफी हद तक अलगाव और आंख antennal डिस्क के बाद उपचार पर ध्यान केंद्रित किया गया है, यह अलग और विंग, haltere, पैर और जननांग डिस्क (चित्रा 4) का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा करने के लिए उत?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम JPK मूल imaginal डिस्क विच्छेदन प्रक्रिया को पढ़ाने के लिए डोनाल्ड तैयार और केविन मूसा को धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी चित्रा 1 बी में जननांग डिस्क और चित्रा 3 चित्रा 2A, ब्रैंडन Weasner में आंख डिस्क के लिए बोनी Weasner धन्यवाद, मक्खी दाग के लिए ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक केंद्र और एंटीबॉडी के लिए विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक. सीएमएस स्वास्थ्य (एनआईएच) GCMS प्रशिक्षण अनुदान के राष्ट्रीय संस्थान (T32-GM007757), फ्रैंक डब्ल्यू पुटनाम रिसर्च फैलोशिप, और रॉबर्ट ब्रिग्स रिसर्च फैलोशिप से एक वजीफा द्वारा समर्थित किया गया है. JPK राष्ट्रीय नेत्र संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित है (R01 EY014863)
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150x20mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | N/A | Used for fixation of imaginal disc complexes |
| 50ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | N/A | |
| Small Stir Bar | Various Vendors | N/A | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask |
| 50ml Conical Tubes | Various Vendors | N/A | |
| 1.5ml Microfuge Tubes | Various Vendors | N/A | Clear or Dark depending upon application |
| Microfuge Rack | Various Vendors | N/A | |
| Benchtop Rotator | Various Vendors | N/A | 100ul volume should not splatter at low setting |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum` | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | N/A | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer |
| Seondary Antibodies | Various Vendors | N/A | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18x18mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | NA | Prevents Glass slides from adhering to silicone base |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | NA | Use to gently lower coverslip on to samples |
Riferimenti
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