وبيوشيب الكهروكيميائية استنادا ميكروفلويديك لتسمية خالية تحليل الحمض النووي التهجين
Summary
نقدم بيوشيب القائم ميكروفلويديك الكهروكيميائية للكشف عن تهجين الحمض النووي. التالية ssDNA التحقيق functionalization، يتم دراسة خصوصية وحساسية، والحد من الكشف مع أهداف ssDNA تكميلية وغير تكميلية. وتوضح النتائج أن تأثير الأحداث تهجين الحمض النووي على النظام الكهروكيميائية، مع حد الكشف عن 3.8 نانومتر.
Abstract
التصغير من الإجراءات التحليلية في الفوق الصغيرة الحجم يوفر مزايا هامة في ما يخص وقت رد الفعل، والتكلفة، والتكامل من الخطوات السابقة للتجهيز. استخدام هذه الأجهزة نحو تحليل الأحداث تهجين الحمض النووي هو مهم لأنه يقدم تكنولوجيا لتقييم الوقت الحقيقي من المؤشرات الحيوية في نقطة من الرعاية لمختلف الأمراض. ومع ذلك، عندما يقلل من البصمة جهاز هيمنة مختلف الظواهر الفيزيائية الزيادات. هذه الظواهر تؤثر على دقة تصنيع وموثوقية تشغيل الجهاز. ولذلك، هناك حاجة كبيرة لافتعال بدقة وتعمل هذه الأجهزة بطريقة استنساخه من أجل تحسين الأداء العام. هنا، نحن تصف البروتوكولات والأساليب المستخدمة لتصنيع وتشغيل بيوشيب الكهروكيميائية استنادا ميكروفلويديك لتحليل دقيق للأحداث تهجين الحمض النووي. يتكون بيوشيب من جزأين: شريحة ميكروفلويديك معثلاث قنوات صغيرة موازية مصنوعة من (PDMS) polydimethylsiloxane، و 3 × 3 العريض الكهروكيميائية الدقيقة رقاقة. تم الكشف عن الأحداث تهجين الحمض النووي باستخدام مقاومة الكهروكيميائية الطيفي (EIS) التحليل. تحليل EIS يتيح مراقبة التغيرات في خصائص النظام الكهروكيميائية التي هي المهيمنة في هذه المقاييس طول. مع القدرة على رصد التغيرات في كل من تهمة نقل والمقاومة الأنتشارى مع جهاز الاستشعار البيولوجي، ونحن لشرح الانتقائية لأهداف ssDNA التكميلية، حد كشف حساب من 3.8 نانومتر، و 13٪ عبر التفاعل مع غيرها من ssDNA غير التكميلية التالية 20 دقيقة من الحضانة. هذه المنهجية يمكن تحسين أداء الأجهزة المنمنمة التي كتبها توضيح على سلوك نشر في النظام الصغيرة الحجم وذلك من خلال تمكين دراسة الأحداث تهجين الحمض النووي.
Introduction
المختبر على واحد في رقاقة ميكروفلويديك الأجهزة (LOC) توفر مزايا عديدة في التشخيص السريري، والرصد البيئي والبحوث الطبية الحيوية. هذه الأجهزة تستخدم قنوات ميكروفلويديك للسيطرة على تدفق السوائل لمناطق رقاقة حيث مجموعة متنوعة من الإجراءات يمكن أن تأخذ مكان بما في ذلك خلط الكاشف، استنادا تقارب ملزمة، نقل الإشارة، وزراعة الخلايا 1-4. ويوفر مزايا عديدة أكثر على microfluidics أدوات التشخيص السريرية التقليدية مثل القراء لوحة microwell أو الكهربي المقايسات تحول جل. تتطلب أجهزة ميكروفلويديك 2 إلى 3 أوامر من حجم (nanoliters بدلا من ميكرولتر) أقل الكواشف لإجراء فحوصات مماثلة. أيضا، يمكن لهذه الأجهزة أن تزيد من السرعة التي تحدث بعض الأحداث البيولوجية بسبب الحبس أصغر من الأنواع داخل القنوات 5،6. ثالثا، وأجهزة الاستشعار يمكن دمجها داخل الأجهزة ميكروفلويديك باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية والحفر، والتي يمكن أن توفر خالية من التسمية detectioن. وأخيرا، وهذه الأجهزة غير مكلفة لإنتاج وتتطلب القليل من العمل من جانب فني للعمل 7-10.
كشف خالية من التسمية عادة ما يتم تنفيذ باستخدام المفاتيح الضوئية أو الكهربائية. يمكن للأجهزة البصرية يقدم أداء أفضل الاستشعار بسبب التدخل أقل مع التحاليل في العينة. ومع ذلك، فإن خطر أدائهم في الحالات التي يكون فيها خلفية العينة لها نفس الطول الموجي للصدى وأجهزة الاستشعار 11. هناك العديد من المزايا لاستخدام الإشارات الكهربائية لإجراء الكشف البيولوجي والكيميائي في أنظمة ميكروفلويديك. تلفيق هي بطبيعتها أقل تعقيدا منذ هذه المجسات عادة لا تتطلب سوى أقطاب نمط التشغيل. بالإضافة إلى ذلك، إشارات كهربائية يمكن ربطه مباشرة مع معظم معدات القياس في حين طرائق إشارة أخرى قد تتطلب محول لتحويل إشارة 12-15. أجهزة الاستشعار الكهربائية عادة قياس التغيرات في impedancه 16،17، 18 السعة، أو الأكسدة النشاط 19. ومع ذلك، وتعرض كما هي المنمنمة هذه النظم تحديات جديدة. أهم التحديات للتغلب على ما يلي: إعداد العينات وخلط السوائل (بسبب حجم العينة منخفض وعدد رينولدز)، والتأثيرات الفيزيائية والكيميائية (بما في ذلك القوات الشعرية، خشونة السطح، والتفاعلات الكيميائية بين مواد البناء والتحاليل)، وانخفاض signal- نسبة إلى الضجيج (التي تنتجها المنطقة السطحية وخفض حجم) 20-23، والتدخل المحتمل من التحاليل الكهربائية نشط في العينات البيولوجية المعقدة (مثل الدم واللعاب). سوف مزيد من التحقيق في هذه الآثار تؤدي إلى المبادئ التوجيهية لتصنيع دقيق وتشغيل هذه الأجهزة بطريقة استنساخه التي من شأنها تحسين على أدائها العام.
ويستخدم على نطاق واسع كشف تهجين الحمض النووي لتشخيص الاضطرابات الوراثية 24،25 ومختلف أشكال ملغاةإيه 26. كل عام، ويتم تحديد سلالات متعددة من الانفلونزا في المرضى الذين يستخدمون النتائج من تقنيات تهجين الحمض النووي 27. فيروس الانفلونزا وحده مسؤولا عن 36،000 حالة وفاة سنويا في الولايات المتحدة 28. هذه الأمثلة يمكن أن تستفيد من مقعد بين كبار جهاز ميكروفلويديك التي يمكن أن تؤدي تقنيات فحص نفس قارئ لوحة أو هلام تحول الفحص مع انخفاض حجم العينة وعلى جزء صغير من التكلفة دون التضحية حساسية أو خصوصية. بسبب العديد من المزايا من خالية من التسمية الاستشعار الكهروكيميائية، وقد استخدم على نطاق واسع للكشف عن الأحداث تهجين الحمض النووي 29،30. الإعداد حيث انخفضت أقطاب المستوى الكلي (في حدود المليمتر) في الأكواب مع الحل من الفائدة يمكن استخدامها لتوفير البيانات الحساسة للغاية فيما يتعلق حركية ملزمة واحدة من تسلسل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل لمطابقة تسلسل التي تكمل بعضها بعضا. مؤخرا، كان هناك عدد قليل من التقدم في دمج الاستشعار الكهروكيميائية في ميكرofluidics لتهجين الحمض النووي. وقد أجريت دراسات فيما يتعلق حركية تهجين 31 ودمج أجهزة استشعار للكشف عن 15 في قنوات ميكروفلويديك. ومع ذلك، لا تزال هناك حاجة للحصول على إنتاجية عالية جهاز ميكروفلويديك السريع الذي يمكن تحليل الأحداث تهجين الحمض النووي بالتوازي دون خطوات إعداد العينات المعقدة.
الجهاز الواردة في هذا العمل يوفر منصة تسمح للتفاعل متعددة ليتم فحص بالتوازي وبدون خطوات إعداد العينات المعقدة. يقدم بروتوكول لدينا كيف ميكروفلويديك القائم وmicrofabricated biochips الكهروكيميائية مع النظم الكهروميكانيكية الدقيقة (MEMS) التكنولوجيا 32،33. وصفنا عملية تصنيع كل من رقاقة ميكروفلويديك، مصنوعة من polydimethylsiloxane (PDMS)، ورقاقة الكهروكيميائية، تتألف من مجموعة من الأقطاب الكهربائية. وتناولت أيضا functionalization الكيميائية للبيوشيب مع تحقيقات ssDNA. وأخيرا، فإن أبيويتجلى إيتي لجهاز الاستشعار البيولوجي للكشف على وجه التحديد وتحليل الأهداف ssDNA. وعموما، فإن بيوشيب الكهروكيميائية القائم ميكروفلويديك هي تقنية سريعة وتحليل الإنتاجية العالية. ويمكن استخدامه للتحقيق في التفاعلات بين الجزيئات البيولوجية ومحولات إجراء، ويمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من التطبيقات المختبر على واحد في رقاقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تثبت إجراءاتنا تصنيع وبيوشيب الكهروكيميائية القائم ميكروفلويديك واستخدامه لتحليل الأحداث تهجين الحمض النووي. من خلال عملية التصنيع الدقيق عالية الغلة تسيطر علينا تطوير جهاز تتألف من قنوات الميكروسكيل متكاملة مع مجموعة واسعة من محولات الطاقة الكهروكيميائية. لقد و…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفون تقر مؤسسة روبرت دبليو الألمانية، ووكالة الدفاع لتقليص التهديد (DTRA)، ومؤسسة العلوم الوطنية الناشئة حدود في البحث والابتكار (EFRI) للحصول على الدعم المالي. شكرا الكتاب أيضا ماريلاند Nanocenter وFablab من أجل دعم مرفق غرف الأبحاث.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Material | |||
| 4'' Silicon wafer | Ultrasil | 4-5664 | Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm*cm |
| Shipley 1813 photoresist ("PR1") | Microchem | positive photoresist | |
| AZ5214 photoresist ("PR2") | Hoechst Celanse | positive photoresist | |
| SU-8 50 photoresist ("PR3") | Microchem | negative photoresist | |
| Gold etchant | Transene | TFA | No dilution |
| Chromium etchant | Transene | 1020AC | No dilution |
| PDMS elastomer | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Biopsy punching tool | Healthlink | BP20 | |
| Tygon flexible tubing | Cole Parmer | R 3603 | .015" |
| Tygon flexible adapter | Cole Parmer | 06417-41 | .0625" |
| 1 mL syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Monobasic potassium phosphate | Fluka | 1551139 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Sigma | RES20765-A7 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x concentrated saline-sodium citrate buffer | Sigma | 93017 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Aldrich | 455946 | |
| Sodium ferrocyanide | Aldrich | CDS001589 | |
| Target ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/AAAGCTCCGATAGCGCTCCG TGGACGTCCC-3’ |
| Complementary ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’ |
| Target ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’ |
| Complementary ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’ |
| Target ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’ |
| Complementary ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’ |
| Instrument | |||
| Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Chamber pressure 1000 mTorr, Tempreture 200 celsius degrees, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Angstrom/minute. |
| DC sputtering unit | AJA International | ATC 1800-V | For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min. |
| E-beam evaporation system | Denton | Custom-built | For Titanium: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Angstrom/second. For Platinum: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Angstrom/second. |
| Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS230 |
Riferimenti
- Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
- Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
- Xu, Y., Yang, X., Wang, E. Review: aptamers in microfluidic chips. Anal. Chim. Acta. 683, 12-20 (2010).
- Yang, W., Woolley, A. T. Integrated multiprocess microfluidic systems for automating analysis. J. Lab. Automat. 15, 198-209 (2010).
- Gervais, T., Jensen, K. F. Mass transport and surface reactions in microfluidic systems. Chem. Eng. Sci. 61, 1102-1121 (2006).
- Song, H., Ismagilov, R. F. Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents. J. Am. Chem. Soc. 125, 14613-14619 (2003).
- Jiang, H., Weng, X. A., Li, D. Q. Microfluidic whole-blood immunoassays. Microfluid. Nanofluid. 10, 941-964 (2011).
- Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: an overview. Sensors. 11, 5754-5768 (2011).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 210-218 (2006).
- Craighead, H. Future lab-on-a-chip technologies for interrogating individual molecules. Nature. 442, 387-393 (2006).
- Hunt, H. K., Armani, A. M. Label-free biological and chemical sensors. Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).
- Dukkipati, V. R., Pang, S. W. Integrated microfluidic system for DNA analysis. IEEE-NANO 2006. Sixth IEEE Conference on Nanotechnology. 1, 162-165 (2006).
- Fang, T. H., et al. Real-time PCR microfluidic devices with concurrent electrochemical detection. Biosens. Bioelectron. 24, 2131-2136 (2009).
- Pavlovic, E., et al. Microfluidic device architecture for electrochemical patterning and detection of multiple DNA sequences. Langmuir. 24, 1102-1107 (2008).
- Xu, X., Zhang, S., Chen, H., Kong, J. Integration of electrochemistry in micro-total analysis systems for biochemical assays: recent developments. Talanta. 80, 8-18 (2009).
- Cai, H., Lee, T. M. -. H., Hsing, I. M. Label-free protein recognition using an aptamer-based impedance measurement assay. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 433-437 (2006).
- Iliescu, C., Poenar, D. P., Carp, M., Loe, F. C. A Microfluidic device for impedance spectroscopy analysis of biological samples. Sensor. Actuat. B-Chem. 123, 168-176 (2007).
- Prakash, S. B., Abshire, P. Tracking cancer cell proliferation on a CMOS capacitance sensor chip. Biosens. Bioelectron. 23, 1449-1457 (2008).
- Yamaguchi, A., et al. Rapid fabrication of electrochemical enzyme sensor chip using polydimethylsiloxane microfluidic channel. Anal. Chim. Acta. 468, 143-152 (2002).
- Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 261-286 (2002).
- Mariella, R. Sample preparation: the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomed. Microdevices. 10, 777-784 (2008).
- Bhushan, B. . Springer handbook of nanotechnology. , (2010).
- Ghallab, Y. H., Badawy, W. . Lab-on-a-chip: Techniques, circuits, and biomedical applications. , (2010).
- Chee, M., et al. Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science. 25, 610-614 (1996).
- Ma, K. -. S., Zhou, H., Zoval, J., Madou, M. DNA hybridization detection by label free versus impedance amplifying label with impedance spectroscopy. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 58-64 (2006).
- Ito, T., Hosokawa, K., Maeda, M. Detection of single-base mismatch at distal end of DNA duplex by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 22, 1816-1819 (2007).
- Kao, L. T. -. H., et al. Multiplexed detection and differentiation of the DNA strains for influenza A (H1N1 2009) using a silicon-based microfluidic system. Biosens. Bioelectron. 26, 2006-2011 (2011).
- Li, J., Chen, S., Evans, D. H. Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol. 39, 696-704 (2001).
- Gautier, C., et al. Hybridization-induced interfacial changes detected by non-faradaic impedimetric measurements compared to faradaic approach. J. Electroanal. Chem. 610, 227-233 (2007).
- Ma, Y., Jiao, K., Yang, T., Sun, D. Sensitive PAT gene sequence detection by nano-SiO2/p-aminothiophenol self-assembled films DNA electrochemical biosensor based on impedance measurement. Sensor. Actuat. B-Chem. 131, 565-571 (2008).
- Kim, J. H. -. S., Marafie, A., Jia, X. -. Y., Zoval, J. V., Madou, M. J. Characterization of DNA hybridization kinetics in a microfluidic flow channel. Sensor. Actuat. B-Chem. 113, 281-289 (2006).
- Dykstra, P. H., Roy, V., Byrd, C., Bentley, W. E., Ghodssi, R. Microfluidic electrochemical sensor array for characterizing protein interactions with various functionalized surfaces. Anal. Chem. 83, 5920-5927 (2011).
- Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Bentley, W. E., Ghodssi, R. A Microfluidic-based electrochemical biochip for label-free diffusion-restricted DNA hybridization analysis. Biosens. Bioelectron. 38, 114-120 (2012).
- Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. Self-assembled monolayers for biosensors. Analyst. 122, 43R-50R (1997).
- McEwen, G. D., Chen, F., Zhou, A. Immobilization, hybridization, and oxidation of synthetic DNA on gold surface: Electron transfer investigated by electrochemistry and scanning tunneling microscopy. Anal. Chim. Acta. 643, 26-37 (2009).
- Arinaga, K., Rant, U., Tornow, M., Fujita, S., Abstreiter, G., Yokoyama, N. The role of surface charging during the coadsorption of mercaptohexanol to DNA layers on gold: Direct observation of desorption and layer reorientation. Langmuir. 22, 5560-5562 (2006).
- Katz, E., Willner, I. Probing biomolecular interactions at conductive and semiconductive surfaces by impedance spectroscopy: Routes to impedimetric immunosensors, DNA-sensors, and enzyme biosensors. Electroanalysis. 15, 913-947 (2003).
