लेबल मुक्त डीएनए संकरण विश्लेषण के लिए एक microfluidic आधारित विद्युत Biochip
Summary
हम डीएनए संकरण का पता लगाने के लिए एक microfluidic आधारित विद्युत biochip प्रस्तुत करते हैं. SsDNA जांच functionalization के बाद, विशिष्टता, संवेदनशीलता, और सीमा का पता लगाने पूरक और गैर पूरक ssDNA लक्ष्य के साथ अध्ययन कर रहे हैं. परिणाम 3.8 एनएम की एक सीमा का पता लगाने के साथ, विद्युत प्रणाली पर डीएनए संकरण की घटनाओं के प्रभाव को वर्णन.
Abstract
सूक्ष्म पैमाने में विश्लेषणात्मक benchtop प्रक्रियाओं के miniaturization प्रतिक्रिया समय, लागत, और पूर्व प्रसंस्करण कदम के एकीकरण के संबंध में महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है. यह बिंदु का ख्याल विभिन्न रोगों के लिए कम से बायोमार्कर की वास्तविक समय मूल्यांकन के लिए एक प्रौद्योगिकी प्रदान करता है क्योंकि डीएनए संकरण की घटनाओं का विश्लेषण करने की दिशा में इन उपकरणों का उपयोग महत्वपूर्ण है. हालांकि, जब डिवाइस पदचिह्न विभिन्न भौतिक घटना का बढ़ता प्रभुत्व कम हो जाती है. ये घटना निर्माण सटीक और डिवाइस के संचालन विश्वसनीयता प्रभावित करते हैं. इसलिए, सही ढंग से समग्र प्रदर्शन में सुधार के क्रम में एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से इन उपकरणों के निर्माण और संचालित करने के लिए एक बड़ी जरूरत है. यहाँ, हम प्रोटोकॉल और निर्माण और डीएनए संकरण की घटनाओं का सटीक विश्लेषण के लिए एक microfluidic आधारित विद्युत biochip के आपरेशन के लिए इस्तेमाल किया तरीकों का वर्णन. biochip दो भागों से बना है: एक microfluidic चिप के साथतीन polydimethylsiloxane (PDMS) से बना समानांतर सूक्ष्म चैनलों, और 3 एक्स 3 arrayed विद्युत माइक्रो चिप. डीएनए संकरण की घटनाओं विद्युत प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी (EIS) विश्लेषण का उपयोग कर पता चला रहे हैं. EIS विश्लेषण इन लंबाई तराजू पर प्रमुख हैं कि विद्युत प्रणाली की संपत्तियों की निगरानी विविधताओं सक्षम बनाता है. Biosensor साथ दोनों चार्ज हस्तांतरण और diffusional प्रतिरोध के परिवर्तन की निगरानी करने की क्षमता के साथ, हम 20 मिनट निम्नलिखित पूरक ssDNA लक्ष्य को चयनात्मकता, 3.8 एनएम के एक गणना की सीमा का पता लगाने, और अन्य गैर पूरक ssDNA साथ एक 13% पार जेट का प्रदर्शन ऊष्मायन की. इस पद्धति सूक्ष्म पैमाने शासन में प्रसार के व्यवहार पर elucidating द्वारा और डीएनए संकरण की घटनाओं के अध्ययन को सक्षम करने से छोटी उपकरणों के प्रदर्शन में सुधार कर सकते हैं.
Introduction
Microfluidic प्रयोगशाला पर एक चिप (एलओसी) उपकरणों नैदानिक निदान, पर्यावरण निगरानी और जैव चिकित्सा अनुसंधान में कई फायदे प्रदान करते हैं. इन उपकरणों प्रक्रियाओं की एक किस्म 1-4 संवर्धन अभिकर्मक मिश्रण, बाध्यकारी आधारित आत्मीयता, संकेत पारगमन, और सेल सहित जगह ले जा सकते हैं जहां चिप के क्षेत्रों के लिए तरल पदार्थ के प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए microfluidic चैनलों का उपयोग. Microfluidics ऐसे microwell प्लेट पाठकों या electrophoretic जेल शिफ्ट assays के रूप में पारंपरिक नैदानिक नैदानिक उपकरणों पर कई लाभ प्रदान करता है. इसी तरह assays के प्रदर्शन करने के लिए कम अभिकर्मकों (microliters के विरोध के रूप nanoliters) microfluidic उपकरणों परिमाण के 2 से 3 आदेश की आवश्यकता होती है. इसके अलावा, इन उपकरणों के कुछ जैविक घटनाओं चैनलों 5,6 के भीतर प्रजातियों के छोटे कारावास की वजह से होते हैं जिसके द्वारा गति बढ़ा सकते हैं. तीसरा, सेंसर लेबल से मुक्त detectio प्रदान कर सकते हैं जो लिथोग्राफी और नक़्क़ाशी तकनीक का उपयोग microfluidic उपकरणों, के भीतर एकीकृत किया जा सकता हैएन. अन्त में, इन उपकरणों के उत्पादन और 7-10 संचालित करने के लिए तकनीशियन की ओर से छोटे से काम की आवश्यकता के लिए सस्ती कर रहे हैं.
लेबल से मुक्त पता लगाने के लिए आम तौर पर एक ऑप्टिकल या बिजली ट्रांसड्यूसर का उपयोग किया जाता है. ऑप्टिकल उपकरणों की वजह से नमूने में analytes साथ कम हस्तक्षेप करने के लिए बेहतर संवेदन प्रदर्शन पेश कर सकते हैं. फिर भी, उनके प्रदर्शन नमूना की पृष्ठभूमि संवेदक 11 के रूप में ही गूंज तरंगदैर्ध्य है जहां मामलों में समझौता किया है. Microfluidic प्रणालियों में जैविक और रासायनिक पता लगाने के प्रदर्शन करने के लिए विद्युत संकेतों का उपयोग करने के कई फायदे हैं. इन सेंसरों आम तौर पर केवल संचालित करने के लिए नमूनों इलेक्ट्रोड की आवश्यकता के बाद से निर्माण स्वाभाविक कम जटिल है. अन्य संकेत के तौर तरीकों संकेत 12-15 कन्वर्ट करने के लिए एक ट्रांसड्यूसर की आवश्यकता हो सकती है, जबकि इसके अलावा, विद्युत संकेतों को सीधे सबसे माप उपकरणों के साथ interfaced किया जा सकता है. विद्युत सेंसर आमतौर impedanc में बदलाव को मापनेई 16,17, समाई 18, या redox गतिविधि 19. इन प्रणालियों छोटी कर रहे हैं लेकिन, जैसा कि नई चुनौतियां पेश कर रहे हैं. काबू पाने के लिए सबसे महत्वपूर्ण चुनौतियों में शामिल हैं: नमूना तैयार करने और (कारण कम नमूना मात्रा और रेनॉल्ड्स संख्या के लिए) के तरल पदार्थ के मिश्रण, भौतिक और रासायनिक प्रभाव (केशिका बलों सहित, सतह खुरदरापन, निर्माण सामग्री और analytes के बीच रासायनिक बातचीत), कम संकेत जटिल जैविक नमूने (जैसे, रक्त और लार) में विद्युत सक्रिय analytes से 20-23, और संभावित हस्तक्षेप (कम सतह क्षेत्र और मात्रा द्वारा उत्पादित) से शोर अनुपात. इन प्रभावों की आगे की जांच उनके समग्र प्रदर्शन पर सुधार होगा कि एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से इन उपकरणों का सही निर्माण और संचालन के लिए दिशा निर्देश दिए जाएंगे.
डीएनए संकरण का पता लगाने आनुवंशिक विकारों 24,25 और CANC के विभिन्न रूपों का निदान करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया जाता हैएर 26. हर साल, इन्फ्लूएंजा के कई उपभेदों डीएनए संकरण तकनीक 27 से परिणाम का उपयोग रोगियों में पहचाने जाते हैं. इन्फ्लूएंजा वायरस संयुक्त राज्य अमेरिका अकेले 28 में 36,000 लोगों की मृत्यु प्रत्येक वर्ष के लिए खातों. ऐसे उदाहरण संवेदनशीलता या विशिष्टता का त्याग किए बिना कम नमूना मात्रा के साथ एक थाली पाठक या जेल शिफ्ट परख के रूप में और लागत का एक अंश में एक ही परख तकनीक प्रदर्शन कर सकते हैं कि एक पीठ टॉप microfluidic डिवाइस से फायदा हो सकता है. कारण लेबल से मुक्त विद्युत संवेदन के कई फायदे के लिए, यह डीएनए संकरण की घटनाओं 29,30 का पता लगाने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. (मिलीमीटर रेंज में) वृहद पैमाने पर इलेक्ट्रोड ब्याज के समाधान के साथ बीकर में डूबा हुआ है, जहां एक सेटअप उनके मिलान पूरक दृश्यों के लिए एकल असहाय डीएनए दृश्यों के बंधन कैनेटीक्स के बारे में बहुत संवेदनशील डेटा प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हाल ही में, माइकर में विद्युत संवेदन शामिल करने में कुछ अग्रिम रहे हैंडीएनए संकरण के लिए ofluidics. अध्ययन संकरण कैनेटीक्स 31 और microfluidic चैनलों में पता लगाने के लिए 15 के लिए सेंसर के एकीकरण के संबंध में प्रदर्शन किया गया है. हालांकि, अभी भी जटिल नमूना तैयार कदम बिना समानांतर में डीएनए संकरण की घटनाओं का विश्लेषण कर सकते हैं कि एक तेजी से उच्च throughput microfluidic डिवाइस की आवश्यकता मौजूद है.
इस काम में प्रस्तुत युक्ति एकाधिक बातचीत समानांतर में और जटिल नमूना तैयार कदम बिना जांच किए जाने के लिए अनुमति देता है कि एक मंच प्रदान करता है. हमारी प्रोटोकॉल विद्युत biochips सूक्ष्म विद्युत प्रणाली (एमईएमएस) प्रौद्योगिकी 32,33 के साथ microfabricated कर रहे हैं कि कैसे microfluidic आधारित प्रस्तुत करता है. हम इलेक्ट्रोड की एक सरणी के शामिल (PDMS) polydimethylsiloxane से बना microfluidic चिप, और विद्युत चिप दोनों के निर्माण की प्रक्रिया का वर्णन. ssDNA जांच के साथ biochip की रासायनिक functionalization भी संबोधित किया है. अंत में, abilविशेष रूप से ssDNA ठिकानों का पता लगाने और विश्लेषण करने के लिए biosensor के अल्पसंख्यक प्रदर्शन किया है. कुल मिलाकर, microfluidic आधारित विद्युत biochip एक तेजी से और उच्च throughput विश्लेषण तकनीक है. यह जैविक अणुओं और आयोजित करने transducers के बीच बातचीत की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और प्रयोगशाला पर एक चिप आवेदनों की एक किस्म में उपयोग किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारी प्रक्रियाओं एक microfluidic आधारित विद्युत biochip के निर्माण और डीएनए संकरण की घटनाओं के विश्लेषण के लिए इसके उपयोग का प्रदर्शन. एक उच्च उपज नियंत्रित microfabrication प्रक्रिया के माध्यम से हम विद्युत transducers के एक सरण?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों वित्तीय सहायता के लिए रॉबर्ट डब्ल्यू Deutsch फाउंडेशन, डिफेंस थ्रेट रिडक्शन एजेंसी (DTRA), और अनुसंधान में राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन इमर्जिंग फ्रंटियर्स और अभिनव (EFRI) स्वीकार करते हैं. लेखकों को भी cleanroom सुविधा समर्थन के लिए मैरीलैंड Nanocenter और उसके Fablab धन्यवाद.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Material | |||
| 4'' Silicon wafer | Ultrasil | 4-5664 | Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm*cm |
| Shipley 1813 photoresist ("PR1") | Microchem | positive photoresist | |
| AZ5214 photoresist ("PR2") | Hoechst Celanse | positive photoresist | |
| SU-8 50 photoresist ("PR3") | Microchem | negative photoresist | |
| Gold etchant | Transene | TFA | No dilution |
| Chromium etchant | Transene | 1020AC | No dilution |
| PDMS elastomer | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Biopsy punching tool | Healthlink | BP20 | |
| Tygon flexible tubing | Cole Parmer | R 3603 | .015" |
| Tygon flexible adapter | Cole Parmer | 06417-41 | .0625" |
| 1 mL syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Monobasic potassium phosphate | Fluka | 1551139 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Sigma | RES20765-A7 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x concentrated saline-sodium citrate buffer | Sigma | 93017 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Aldrich | 455946 | |
| Sodium ferrocyanide | Aldrich | CDS001589 | |
| Target ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/AAAGCTCCGATAGCGCTCCG TGGACGTCCC-3’ |
| Complementary ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’ |
| Target ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’ |
| Complementary ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’ |
| Target ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’ |
| Complementary ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’ |
| Instrument | |||
| Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Chamber pressure 1000 mTorr, Tempreture 200 celsius degrees, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Angstrom/minute. |
| DC sputtering unit | AJA International | ATC 1800-V | For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min. |
| E-beam evaporation system | Denton | Custom-built | For Titanium: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Angstrom/second. For Platinum: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Angstrom/second. |
| Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS230 |
Riferimenti
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