쥐과 림프절 기질 세포의 분리
Summary
Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.
Abstract
Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.
Introduction
림프절은 외국과 자기 항원에 대한 적응 면역 반응이 시작되고 조정되는 전문 구획입니다. 여기에 제시된 절차 림프절 단일 세포 현탁액을 수득하고 여러 분자의 표면 발현을 유지 가능한 림프절 기질 세포에 접근하기 위해 자동화 된 기계적인 피펫 결합 단편의 효소 소화를 설명한다.
림프절 기질 세포가 세 가지 주요 기능을 림프 노드의 골격을 형성하고 이행 : 첫째가 체액 항원, 병원균과 병원균 관련 분자 패턴 (PAMPS)뿐만 아니라, 사이토 카인 및 위험 관련 분자 패턴을 샘플링 필터 (감쇠) 본 몸에. 둘째, 상호 작용 및 적응 면역 반응을 시작하는 항원 제시 세포 (APC)와 림프구를 유치하고 지시; 셋째, 이들은 하나의 림프구 항상성 및 분화 구조 환경을 제공-3입니다. 염증 림프절 기질 세포는 성장 인자, 사이토 카인 및 케모카인을 생산하는 동안, 수지상 세포 간의 상호 작용을 편성함으로써, T- 및 B- 세포 종기에 적응. 면역 반응의 오케스트레이션으로 인해 서로 다른 기질 세포 집단에 의해 형성되는 복잡한 구조 아키텍처에만 가능합니다.
림프절 간질 세포가 CD45 음성 세포와 섬유 모세포하며 내피 세포 1-6에서 CD31의 발현 또는 gp38에 의해 구별 될 수있다. CD31 + 혈액 내피 세포를 정의 (BEC)를 – gp38 + CD31 + 림프 내피 세포 (LEC), gp38를 정의 – Gp38 + CD31는 (섬유 모세포 망상 세포 또한 FRC로 알려진 TRC) T 존 망상 세포를 정의합니다. 또한, 특정 집단의 특성은 다른 림프절 기질 세포의 존재를 한 것으로 밝혀졌습니다. 실제로 작은 주연 세포와 같은 세포 집단은 내에 특성화시켰다gp38 – CD31 – 인구 7. 따라서, 분리 절차의 적응은 다른 림프절 기질 세포의 기능적 특성의 확인 및 특성화를 위해 유리하다.
림프절 기질 세포 소화 개발 전에 림프절 기질 세포의 연구는 조직 절편 및 현미경을 이용한 관찰에 시츄로 제한 프로토콜. 그럼에도 불구하고, 구조적 및 기능적 연구는 림프절 기질 세포의 중요한 특성을 보였다. 림프절 기질 세포는 높은 내피로 림프절의 낭하 부비동에서 림프와 연관된 낮은 분자량 단백질을 수송 도관 시스템이라고 복잡한 3 차원 구조를 형성하기 위해 podoplanin, 콜라겐과 세포 외 기질 (ECM) 단백질과 연결된 T 세포 영역에서 8 세정맥. 수지상 세포는 간질에 밀착되고 관형 콘으로 돌출 관찰 될 수있다duit 구조는 유체 샘플 8 및 항원을 검출한다. 수지상 세포와 림프절 기질 세포 (TRC를 사용해 및 수정체 상피)의 상호 작용은 케모카인의 CCL21와 CCL19 9, 10의 출시와 프리젠 테이션에 의해 매개된다. CCL19와 CCL21은 림프절의 T 세포 영역 4,11로 이전 수지상 및 T 세포를 촉진 CCR7 수용체에 의해 인식됩니다. 비슷한 케모카인을 사용에도 불구하고, 수지상와 T 세포는 림프절 (12)에 서로 다른 이동 경로를 가지고있다. 나중에, 림프절 및 순수한 림프절 기질 세포의 분리의 소화 효소를 사용하여 기능적 연구는 상이한 림프절 간질 세포의 역할과 수지상 세포와 T / B 세포 6,13와 상호 작용하는 그들의 능력에 대해 수행 하였다. 우선, IFN-γ 생산 효과기 T 세포 및 림프절 기질 세포 사이의 크로스 토크는 보조 림프 기관 14-16에서 T 세포 반응과 확산을 저해하는 것으로 대사 산화 질소의 생산을 유도한다. 둘째, 림프 N송시 기질 세포는 IL-10 (17)의 생산을 통해 규제 DC 서브 세트들의 분화를 지원하기 위해, 및 IL-7의 제조 6,18 통해 나이브 T 세포의 항상성을 조절하는 것으로보고되었다. 셋째, 림프절 기질 세포의 TLR 발현은 간질 세포가 조직 손상 중에 방출 감염 또는자가 유래의 분자 신호에 민감한 것을 시사한다. 실제로, TLR3 폴리 리간드와 림프절 기질 세포의 치료 (I는 : C)의 결과, 주요 조직 적합성 복합체 클래스 I 발현 및 공동 억제 분자 PD-L1의 상향 조절의 완만 한 상향 조절을 유도하고 있지만 보조 자극 분자 주변 조직의 극적인 변화는 식 (19) 항원. 몇몇 그룹은 림프절 기질 세포가 말초 조직 항원을 발현하고 자기 반응성 T 세포의 19,21-27 내성을 유도 보였다. 따라서, 림프절 기질 세포 및 다른 이동성 재 사이의 상호 작용을 이해sident 림프절 세포는 염증 동안에 활성 또는 면역 반응의 억제를 허용하는 새로운 표적 분자를 찾는 데 도움이 될 것이다. 따라서, 림프절의 발행 효소 분리의 구현이 필요하다.
이전에 게시 된 프로토콜은 낮은 기계적 스트레스 6,19,20와 콜라겐 기반의 효소 소화의 다른 조합을 사용합니다. 그러나 소화 효소 나 소화 효소의 상이한 조합을 가진 긴 인큐베이션 활성화 상태를 분석하고 새로운 림프절 기질 세포를 식별하기 위해 필요한 다양한 표면 분자를 저하 될. 간질 세포 분석의 유형에 따라, 링크 프로토콜 또는 프로토콜 플레쳐 더 적합 할 수도있다. 설명 된 절차에서 다소 짧은 효소 소화가 가능한 림프절 기질 세포 표면 마커의 열화를 최소화하기 위해 자동화 된 기계식 세분화와 결합된다. 이 절차는 재현성이 높은 절연을 가능하게하고낮은 변동성과 95 % 이상의 생존으로 림프절 간질 세포 집단의 차이. 갓 절연 림프절 기질 세포는 시험 관내에서 직접 작용 분석을 수행하는 기질 세포 라인의 표면 마커의 발현, 단백질 분석, 전사 연구뿐만 아니라 설정에 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
림프절 기질 세포의 연구는 최근에 의한 소화 작용이 발행 프로토콜 6,13의 개발에 연구 초점이되었다. 두 프로토콜은 단일 림프절 간질 세포를 획득하기에 적절하지만, 소화 효소의 이용과 소화의 시간 차이가있다. 기질 세포와 그 표면 마커 효소 소화와 기계적 스트레스에 민감하기 때문에, 최적화 된 프로토콜이 필요합니다.
갓 해부 림프절에서 가능한 림프절 기?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Sanjiv Luther and colleagues for helpful discussions in establishing the current lymph node digestion protocol. This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R.
Materials
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | Final concentration 2% | ||
| CaCl2 | Sigma | 499609 | Final concentration 1.2 mM |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | use at 3.5 mg/ml |
| DNAse I | Roche | 11284932001 | use at 40 µg/ml |
| stiring magnets | FAUST | 5 mm long-2 mm ø | |
| Polystyren Round-Bottom Tubes 5ml | Falcon-BD Bioscience | ||
| Magnetic stirrer with heating funktion | IKA-RCT-standard | 9720250 | |
| Petridishes 100 mm, sterile | TPP | 6223201 | |
| 25G needles | Terumo | ||
| anti mouse CD45 Ab | Biolegend | Clone 30-F11 | |
| anti mouse CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| anti mouse Podoplanin Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| anti mouse CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel |
Eppendorf | 4861 000.821/830 | 1.250 µl max. volume |
| anti mouse CD140a | Biolegend | Clone APA5 | |
| anti mouse CD80 | Biolegend | Clone 16-10A1 | |
| anti mouse CD40 | Biolegend | Clone 1C10 | |
| anti mouse I-Ab | Biolegend | Clone AF6-120.1 | |
| anti mouse CD274 (PD-L1) | Biolegend | Clone 10F.9G2 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit | Invitrogen | L10119 |
Riferimenti
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