Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen
Summary
Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.
Abstract
Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.
Introduction
Lymphknoten sind spezialisierte Fächer, wo adaptiven Immunantwort gegen fremde und Selbst-Antigene initiiert und koordiniert. Das hier vorgestellte Verfahren beschreibt eine kurze enzymatische Verdauung kombiniert mit automatisierten mechanischen Pipettieren Lymphknoten Einzelzellsuspension zu erhalten und Zugang zu lebensfähigen Lymphknoten Stromazellen, die die Oberflächenexpression von mehreren Molekülen zu erhalten.
Lymphknoten Stromazellen bilden das Gerüst des Lymphknotens und erfüllen drei wichtige Funktionen: sie filtern ersten Körperflüssigkeiten, Antigene, Krankheitserreger und ihre Erregermuster (PAMPs) sowie Zytokine und Gefahr assoziierte molekulare Muster zu probieren (gedämpft) vorhanden im Körper. Zweitens, sie ziehen und weisen Antigen-präsentierenden Zellen (APC) und Lymphozyten zu interagieren und zu initiieren adaptive Immunantworten; und die dritte, bieten sie eine strukturelle Umgebung für die Homöostase und Differenzierung von Lymphozyten 1-3. Während der Entzündung Lymphknoten Stromazellen produzieren Wachstumsfaktoren, Zytokine und Chemokine, die Anpassung an Schwellungen damit die Organisation der Interaktion zwischen dendritischen Zellen (DCs), T-und B-Zellen. Die Instrumentation von Immunantworten ist aufgrund der komplexen Strukturarchitektur von unterschiedlichen stromalen Zellpopulationen gebildet möglich.
Lymphknoten Stromazellen CD45-negativen Zellen und kann durch die Expression von CD31 und gp38 in Fibroblasten und Endothelzellen 1 -6 unterscheiden. Gp38 + CD31 – T-Zone definiert Retikulumzellen (TRC, die auch als FRC bekannt: fibroblastischen Retikulumzellen), gp38 + CD31 + definiert lymphatischen Endothelzellen (LEC), gp38 – CD31 + definiert Blut Endothelzellen (BEC). Weitere Charakterisierung von Subpopulationen zeigte die Existenz von anderen Lymphknoten Stromazellen. In der Tat wurde eine kleine pericyte artigen Zellpopulation innerhalb der gekennzeichnetgp38 – CD31 – Population 7. Daher ist die Anpassung des Isolationsverfahren zur Identifizierung und Charakterisierung der funktionellen Eigenschaften von verschiedenen Lymphknoten Stromazellen vorteilhaft.
Vor der Entwicklung von Lymphknoten Stromazellen Verdauung Protokolle die Untersuchung von Lymphknoten Stromazellen wurde in situ Beobachtungen mit Gewebeabschnitt und Mikroskopie beschränkt. Dennoch zeigte strukturelle und funktionelle Untersuchungen wichtige Eigenschaften von Lymphknoten Stromazellen. Lymphknoten Stromazellen mit podoplanin, Kollagen und extrazellulärer Matrix (ECM) Proteinen verbunden, um eine komplexe dreidimensionale Struktur 3 genannte Leitungssystem, die Lymphe und assoziierten-niedermolekulare Proteine auf die hohe endotheliale Transporte vom subkapsuläre Sinus des Lymphknotens bilden Venolen in der T-Zellen-Zone 8. DCs sind in engem Kontakt mit Stroma-Zellen und in das rohrförmige con vorstehenden beachtenDuit Struktur zu Probenflüssigkeit und erkennen Antigene 8. Die Wechselwirkung von Lymphknoten Stromazellen (TRCs und LECs) mit DCs ist durch die Freisetzung und Präsentation von Chemokinen CCL21 und CCL19 9,10 vermittelt. CCL19 und CCL21 werden von der CCR7 Rezeptor erleichtert DCs und T-Zellen zu den Lymphknoten T-Zell-Zone 4,11 migrieren anerkannt. Trotz Verwendung ähnlicher Chemokine DCs und T-Zellen haben unterschiedliche Wanderungs in die Lymphknoten 12. Später mittels enzymatischer Verdauung der Lymphknoten und Isolierung von reinem Lymphknoten Stromazellen, funktionelle Studien über die Rolle der verschiedenen Lymphknoten Stromazellen und ihre Fähigkeit, mit DCs und T / B-Zellen interagieren 6,13 durchgeführt. Zuerst wird das Übersprechen zwischen IFN-γ produzierenden T-Effektorzellen und Lymphknoten Stromazellen induziert die Produktion der gezeigten T-Zell-Antworten und die Proliferation in den sekundären lymphoiden Organen 14-16 dämpfen Metaboliten Stickoxid. Zweiten, Lymphe node Stromazellen wurde berichtet, dass die Differenzierung der DC regulatorischen Untergruppen über die Produktion von IL-10-17 zu unterstützen und naiven T-Zell-Homöostase durch die Produktion von IL-7 6,18 modulieren. Drittens TLR-Expression in Lymphknoten stromalen Zellen legt nahe, dass Stromazellen sind anfällig für eine Infektion oder selbst Moleküle während Gewebeverletzung freigesetzt abgeleiteten Signals. Tatsächlich ist die Behandlung von Lymphknoten Stromazellen mit dem Liganden von TLR3 Poly (I: C) induziert eine geringe Hochregulation von Haupthistokompatibilitätskomplex-Klasse-I-Expression und die Hochregulation von Co-inhibitorische Molekül PD-L1, jedoch nicht von kostimulatorischen Molekülen, was zu dramatische Veränderungen im peripheren Gewebe-Antigene Ausdruck 19. Mehrere Gruppen haben gezeigt, Lymphknoten Stromazellen exprimieren peripheren Gewebe-Antigene und induzieren Toleranz von selbstreaktiven T-Zellen 19,21-27. Daher, das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Lymphknoten Stromazellen und die andere Zugvögel und Wiedersident Lymphknotenzellen werden dabei helfen, neue Zielmoleküle zur Aktivierung oder Unterdrückung von Immunreaktionen während der Entzündung ermöglichen zu finden. Daher wird die Umsetzung der veröffentlichten enzymatische Trennung des Lymphknotens erforderlich.
Zuvor veröffentlichten Protokolle verwenden verschiedene Kombinationen von Kollagenase-basierte enzymatische Verdauung mit geringer mechanischer Belastung 6,19,20. Allerdings könnte lange Inkubationen mit Verdauungsenzymen oder andere Kombination von verschiedenen Enzym die Verdauung benötigt, um den Aktivierungsstatus zu analysieren und neue Lymphknoten Stromazellen identifizieren Oberflächenmoleküle abzubauen. Abhängig von der Art der stromalen Zellanalyse, kann die Link-Protocol-Protokoll oder Fletcher besser geeignet sein. Bei dem beschriebenen Verfahren wird eine etwas kürzere enzymatischen Verdau mit automatisierten mechanischen Disaggregation kombiniert, um Oberflächenmarker Abbau von lebensfähigen Lymphknoten Stromazellen minimieren. Diese Vorgehensweise ermöglicht hoch reproduzierbare Isolation undUnterscheidung von Lymphknoten Stroma-Zellpopulationen mit geringer Variabilität und mehr als 95% Lebensfähigkeit. Die frisch isolierten Lymphknoten Stromazellen können direkt für Oberflächenmarker-Expression, Proteinanalyse und Transkriptionsstudien sowie Errichtung Stromazellen Leitungen verwendet, um funktionelle Assays in vitro durchzuführen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Studie von Lymphknoten Stromazellen vor kurzem wurde ein Forschungsschwerpunkt auf die Entwicklung von zwei Protokolle veröffentlicht Verdauung 6,13. Beide Protokolle angemessen sind, um einzelne Lymphknoten Stromazellen zu erhalten, unterscheiden sich jedoch in der Verwendung von Verdauungsenzymen und dem Zeitpunkt der Verdauung. Da Stromazellen und ihre Oberflächenmarker empfindlich enzymatischen Verdau und mechanischer Belastung sind, wird ein optimiertes Protokoll erforderlich.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Sanjiv Luther and colleagues for helpful discussions in establishing the current lymph node digestion protocol. This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R.
Materials
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | Final concentration 2% | ||
| CaCl2 | Sigma | 499609 | Final concentration 1.2 mM |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | use at 3.5 mg/ml |
| DNAse I | Roche | 11284932001 | use at 40 µg/ml |
| stiring magnets | FAUST | 5 mm long-2 mm ø | |
| Polystyren Round-Bottom Tubes 5ml | Falcon-BD Bioscience | ||
| Magnetic stirrer with heating funktion | IKA-RCT-standard | 9720250 | |
| Petridishes 100 mm, sterile | TPP | 6223201 | |
| 25G needles | Terumo | ||
| anti mouse CD45 Ab | Biolegend | Clone 30-F11 | |
| anti mouse CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| anti mouse Podoplanin Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| anti mouse CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel |
Eppendorf | 4861 000.821/830 | 1.250 µl max. volume |
| anti mouse CD140a | Biolegend | Clone APA5 | |
| anti mouse CD80 | Biolegend | Clone 16-10A1 | |
| anti mouse CD40 | Biolegend | Clone 1C10 | |
| anti mouse I-Ab | Biolegend | Clone AF6-120.1 | |
| anti mouse CD274 (PD-L1) | Biolegend | Clone 10F.9G2 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit | Invitrogen | L10119 |
Riferimenti
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