Análisis rápido de aberraciones cromosómicas en linfocitos B de ratón por PNA-FISH
Summary
Vías de reparación del ADN son esenciales para el mantenimiento de la integridad genómica y la prevención de la mutación y el cáncer. El objetivo de este protocolo es cuantificar la inestabilidad genómica mediante la observación directa de las aberraciones cromosómicas en metafase se propaga a partir de células B de ratón utilizando hibridación in situ fluorescente (FISH) para las repeticiones teloméricas de ADN.
Abstract
Reparación del ADN defectuoso provoca un aumento de la inestabilidad genómica, que es la causa raíz de las mutaciones que conducen a la tumorigénesis. Análisis de la frecuencia y tipo de aberraciones cromosómicas en diferentes tipos de células permite defectos en las vías de reparación del ADN no se ha dilucidado. Entender la biología de reparación del ADN de los mamíferos se ha ayudado en gran medida por la producción de ratones con nocauts en genes específicos. El objetivo de este protocolo es cuantificar la inestabilidad genómica en los linfocitos B de ratón. Etiquetado de los telómeros con sondas PNA-FISH (ácido nucleico peptídico – hibridación fluorescente in situ) facilita el análisis rápido de la inestabilidad genómica en las extensiones de cromosomas en metafase. Células B tienen ventajas específicas relativas a los fibroblastos, porque tienen la ploidía normal y un índice mitótico superior. Cultivo a corto plazo de las células B, por tanto, permite la medición precisa de la inestabilidad genómica en una población celular primaria que es probable que tenga mutación genética secundaria menoss de lo que se encuentra típicamente en fibroblastos transformados o líneas de células de pacientes.
Introduction
El cáncer es causado por la acumulación de mutaciones que afectan a genes que regulan el crecimiento celular normal. La mutación es una consecuencia de cambios en la estructura y la secuencia del genoma causado por el daño al ADN. Daño del ADN puede ocurrir a través de una variedad de procesos, incluyendo agentes exógenos tales como la radiación ionizante y, como un subproducto del metabolismo celular normal, tales como desaminación espontánea de bases de nucleótidos o daños que se producen por el contacto con especies reactivas de oxígeno 1.
Aunque las células de mamíferos poseen una gama de actividades de reparación que puede revertir el daño de ADN o restaurar la secuencia en los sitios de ruptura, sin embargo, las mutaciones se acumulan durante toda la vida de una célula. Daño del ADN puede contribuir además a senescencia y pérdida de potencia de las células madre, dos procesos que están asociados con la enfermedad de envejecimiento asociado 2. La comprensión de la reparación del daño en el ADN es, por tanto, de vital importancia en el tratamiento de dos signocuestiones ificant en la salud pública. La evidencia creciente sugiere que las vías de reparación del ADN de mamíferos pueden contribuir a la evolución del genoma de células de cáncer 3,4, lo que hace aún más imprescindible para entender los procesos implicados en la supresión de la mutación a nivel molecular.
La visualización directa de las aberraciones cromosómicas es un potente y cuantitativos medio de determinar el grado de inestabilidad genómica en un tipo de célula particular. Cromosomas condensados a partir de células en metafase se pueden aislar e inspeccionados usando luz o microscopía fluorescente. Tales enfoques citogenéticos han sido en la práctica desde hace varias décadas y se pueden utilizar para demostrar la aparición de translocaciones o tipos específicos de aberraciones cromosómicas asociadas con la pérdida de las actividades de reparación del ADN. El protocolo se presta a varias prórrogas posibles: los cromosomas se pueden marcar con sondas para cariotipo espectral (SKY) o fluorescente multicolor de hibridación in situ(MFISH) para identificar las translocaciones 5,6. Estas técnicas permiten también la frecuencia de las translocaciones cromosómicas y la estructura de las translocaciones cromosómicas complejas por determinar, que proporciona información adicional más allá de lo que es posible con este protocolo. Alternativamente, las sondas específicas de secuencia pueden ser generados y utilizados para probar la frecuencia de rotura del ADN en sitios genómicos seleccionados 7.
En este protocolo, se describe la preparación de los cromosomas en metafase se propaga a partir de linfocitos B. Se utiliza un ácido nucleico (PNA) péptido-sonda marcada con fluorescencia para las repeticiones teloméricas, que marca de manera eficiente los telómeros en el cromosoma en metafase se extiende Este protocolo tiene varias ventajas. Las células B pueden ser inducidas a crecer a alto índice mitótico de modo que los diferenciales de alta calidad consistentemente pueden ser producidos. Células B de ratones genéticamente modificados son también mucho menos probable que contenga mutaciones genéticas secundarias que pueden confundir el análisis de la contribuciónde genes específicos a la integridad genómica. El enfoque PNA-FISH se puede completar en un día, y permite anotar más precisa de roturas cromosómicas. Mediante el uso de este enfoque, sobre todo en combinación con el equipo específico que se describe en este protocolo, es posible producir, los diferenciales de alta calidad muy consistentes y analizar rápidamente la velocidad y el tipo de inestabilidad genómica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mientras que los linfocitos B activados son particularmente adecuados para la preparación de extensiones de cromosomas mitóticos, también se pueden utilizar otros tipos de células. Linfocitos T compartir muchas de las ventajas de las células B, ya que pueden ser purificados a partir de los nodos de bazo o de los ganglios, y tienen un alto índice mitótico cuando son estimuladas por el crecimiento en medio que contiene mitógenos apropiados 8. Las células madre embrionarias (células ES) también son ad…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por el NIH subvención R00 CA160574 (SFB) y por una beca del Programa de Entrenamiento de Biotecnología Rutgers (a SMM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
Riferimenti
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