En Lateralized Lukt Learning Model på nyfødte rotter for dissekere nevrale kretser Underpinning Memory Formasjonen

Summary

This protocol introduces lateralized early odor preference learning in rats using acute single naris occlusion. Lateralized learning permits the examination of behavioral outcomes and underpinning biological mechanisms within the same animals, reducing variance induced by between-animal designs. This protocol can be used to investigate molecular mechanisms underpinning early odor learning.

Abstract

Rat pups during a critical postnatal period (≤ 10 days) readily form a preference for an odor that is associated with stimuli mimicking maternal care. Such a preference memory can last from hours, to days, even life-long, depending on training parameters. Early odor preference learning provides us with a model in which the critical changes for a natural form of learning occur in the olfactory circuitry. An additional feature that makes it a powerful tool for the analysis of memory processes is that early odor preference learning can be lateralized via single naris occlusion within the critical period. This is due to the lack of mature anterior commissural connections of the olfactory hemispheres at this early age. This work outlines behavioral protocols for lateralized odor learning using nose plugs. Acute, reversible naris occlusion minimizes tissue and neuronal damages associated with long-term occlusion and more aggressive methods such as cauterization. The lateralized odor learning model permits within-animal comparison, therefore greatly reducing variance compared to between-animal designs. This method has been used successfully to probe the circuit changes in the olfactory system produced by training. Future directions include exploring molecular underpinnings of odor memory using this lateralized learning model; and correlating physiological change with memory strength and durations.

Introduction

Luktesans er den primære sansemodalitet hos gnagere, uten noe som de ikke ville være i stand til å kunne navigere eller overleve i sitt miljø. Det er spesielt viktig for nyfødte valper, som verken kan se eller høre i løpet av første post-natal uke, for å bruke luktesansen for å finne sin mor til å mate ^en. Som et resultat, kan nyfødte rotteunger være betinget til å foretrekke lukt med enkle eksperimentelle manipulasjoner. En rekke stimuli har blitt brukt som ubetinget stimulus (UCS) for å indusere betingede reaksjoner på nye lukt (betinget stimulus, CS) hos nyfødte, herunder reirmiljøet ^2,3, melk diende ^4-6, stryke eller taktil stimulering ^{7- 12,} hale klype ^13, mors spytt ^13, mild foten sjokk ^14-18, og intrakranielle hjernestimulering ^19. Den foreliggende studien anvender en veletablert tidlig lukt preferanse paradigme hvori en lukt, i dette tilfellet peppermynte, is kombinert med taktil stimulering for å produsere en preferanse for peppermynte 24 timer senere ^10,11,20. Lukten minner er avhengig av intakt lukte kretser, først og fremst inkludert lukte pærer (OB) ^21-23 og fremre piriform cortex (APC) ^24,25.

Eksperimentelle undersøkelser av tidlig lukt preferanse læring har fordypet og utvidet vår forståelse av molekylære og fysiologiske fundamentet for en pattedyr minne. Dette pattedyr modellen har flere fordeler i å studere minne mekanismer. For det første har de neurale kilder til UCS-signalet er identifisert. Forskjellige stimuli som nevnt ovenfor stimulerer locus coeruleus noradrenalin frigjøring ^26, som i sin tur aktiverer flere adrenoceptorer i OB, og APC, forårsaker cellulære og fysiologiske virkninger som støtter læring ^22,27,28. For det andre minne-støttemekanismer finne sted i veldefinerte laminære neurale strukturer. Denenkelhet av lukte kretsene i neonatale rotter gir forskerne med ideell ramme med å avdekke de intrikate prosesser knyttet til synaptisk plastisitet. Olfactory sensoriske nevroner (OSN) i lukte epitel prosjekt på mitral / tufted celler i OB og disse mitral / tufted celler i sving prosjektet ipsilaterally til piriform cortex (PC) via lateral luktekanalen (LOT), blant andre strukturer ^29. Både OSN synapser i OB ^30,31 og LOT synapser ^24,25 i aPC har blitt identifisert som kritisk loci for synaptiske endringer som støtter læring og hukommelse. Tredje, i en tidlig alder hos rotter, olfactory innganger kan lett bli lateralized. Hver aPC har tilgang til bilateral lukt informasjon via fremre commissure gang denne hvite saken er fullt dannet ved postnatal dag 12 (PD12) ^32. Før PD 12, kan lukt innspill isoleres til ipisilateral OB og aPC gjennom single Naris okklusjon ^{24,25,31,33,34 <}/ Sup>. Enkelt Naris okklusjon tillater lukt minne formasjon fra den åpne Naris, og hindrer den samme minne fra occluded Naris før til PD 12 ^33. Lukt minne er isolert til ipsilaterale hemisfære inkludert både OB og APC. Derfor kan hver rotte valp være sin egen kontroll for læring og underbygger fysiologi.

I denne studien, er lateralized tidlig lukt preferanse læring protokollen innført. Denne metode tjener som et kraftig verktøy for å studere nevrale mekanismer som ligger til grunn lukt læring ved å tilveiebringe en intra-dyr kontroll ^24,25,31, og dermed redusere både antallet dyr som kreves og den generelle variasjon. Naris okklusjon er reversibel ved at fett eller nesepluggen kan påføres og fjernes med minimalt stress eller skade på dyret. Her først, detaljerte prosedyrer for tidlig lukt preferanse trening og testing er beskrevet, med fokus på lateralized protokollen med singel Naris okklusjon med et nose plugg. Da resultatene er presentert for å demonstrere effektiviteten av enkelt Naris okklusjon i å isolere lukt input og produsere lateralized lukt minne. Endelig er de potensialer for anvendelse av denne lateralized læring modell for å studere fysiologiske forandringer i lukte system som både genererer læring og hukommelse støtte ekspresjon diskutert.

Protocol

Sprague Dawley rat (Charles River) valper av begge kjønn blir brukt. Kull er hentet til 12 på PD1 (fødsel blir PD0). Demningene blir opprettholdt på en 12 timers lys / mørke syklus med ad libitum adgang til mat og vann. Eksperimentelle prosedyrer har blitt godkjent av Memorial University Institutional Animal Care komiteen. 1. Nose Plug Construction MERK:. Denne prosedyren ble tilpasset og endret fra Cummings et al (1997) 35.</su…

Representative Results

Her vi gjennomgå noen av de tidligere etablerte resultater 24 for å demonstrere effektiviteten av Naris okklusjon i å isolere lukt innspill og læring til en halvkule, og den er reversibel denne metoden. Enkelt Naris okklusjon under tidlig lukt preferanse opplæring fører fram til et lateralized lukt minne 24. Minnet er begrenset til spart Naris (figur 3). Når valpene er testet for lukt preferanse med samme Naris tildekket som under trening, de vis…

Discussion

Den lateralized lukt læring og hukommelse modell hos rotteunger i en kritisk tid vindu ble første gang etablert Hall og kolleger. I en rekke studier ^33,34,36, de viste at en lukt preferanse minne kan lateralized av lukt + melke motstandere til en Naris på PD 6 i rotteunger. Minne preferanse var robust når den samme Naris var åpen under trening og testing, men ikke observert når okkludert Naris var avblokkert og testet. Men på PD 12, når fremre kommissurale tilkoblinger fra fremre olfactory cortices bl…

Materials

Polythylene 20 tubing	Intramedic	427406	Non radiopaque, Non toxic
3-0 silk suture thread	Syneture	Sofsilk	Non absorbant
Silicone grease	Warner Instrument	64-0378	Odorless
2% xylocaine gel	AstraZeneca	Prod. No 061	Lidocaine hydrochloride jelly,  purchased at local pharmacy
Paint brush	Dynasty	206R	Similar size/other brands work too
Peppermint extract	Sigma-Aldrich	W284807	Other brand should be okay too
Training box	Custom-made	N/A	Acrylic box (20x20x5cm3), see Figure 2A. Parameters and material for the box are not critical and can be modified. Material used should be odorless and does not absorb odors
Testing chamber	Custom-made	N/A	Stainless steel (30x20x18cm3), see Figure 2B. Parameters and material for the chamber are not critical and can be modified. For example, an acrylic chamber instead of a stainless steel one can be used
pCREB antibody	Cell Signaling	9198	Ser 133 (87G3) Rabbit mAb
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	C8383	N/A
Paraformaldehype	Sigma-Aldrich	P6148	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378	N/A