完整的犁鼻器和副嗅球的体外制剂
Summary
鼠标嗅球（AOB）已难以在感官编码的上下文中学习。在这里，我们表明，产生体外制剂，其中AOB神经元保持功能连接到他们的外设输入，便于研究的小鼠费洛蒙和利它素信息处理解剖。
Abstract
鼠标附件嗅觉系统（AOS）是一个专门感觉传导通路检测非易失性社会异味，费洛蒙，和利它素。第一个神经回路在AOS途径，称为嗅球（AOB），它在建立性的典型行为，如领土的侵略和交配的重要作用。这个小（<1 立方毫米）电路具有区分独特的行为状态，如性别，品系，并在同种的分泌物和排泄物化学感受线索压力的能力。虽然这个系统的紧凑型组织呈现为同时从电路的大部分记录了独特的机会，在AOB感觉处理的调查仍然充满挑战，主要是由于其大脑中的实验不利的位置。在这里，我们证明了多阶段夹层，消除了完好的AOB的前小鼠头盖骨的单个半球内，留下连接离子两者的周犁鼻感觉神经元（的VSN）和局部神经回路完好。该过程公开的AOB表面直接目视检查，便于在没有麻醉剂的电生理和从AOB电路元件的光学记录。在插入细导管进入犁鼻器（VNO），这家的VSN，可以直接在外围暴露于社会的气味和信息素，同时记录在AOB下游活动。此过程使控制查询到AOS信息处理，它可以揭示信息素连接变动风险行为机制的光。
Introduction
在哺乳动物大脑感觉处理通常跨越多个往复连接的神经元回路，其中每个抽取特定的特征从感觉输入。在感觉通路，早期信息处理是正常的认知和行为至关重要。在附件嗅觉系统（AOS）的嗅球（AOB）是感官外围连接到该决定的荷尔蒙平衡1,2，3的侵略和觉醒4下游结构的主要神经回路。因此，该电路内的信息处理是密切相关的变化，动物的行为。
在嗅球位于小鼠和大鼠在主嗅球（MOB）下方的致密的背侧/尾/后一方面，血管化鼻腔鼻窦。该AOB接收传入的神经支配来自驻留在犁鼻器（VNO）的犁鼻周围感觉神经元（的VSN）的轴突，一个SMaL在口鼻前正上方的软腭升盲端管。这些轴突穿越隔组织在鼻腔的内侧边界的微妙片。使用麻醉小鼠5-7或可自由探索动物8一些研究探讨AOB的神经反应，以AOS的气味（如小鼠尿液） 在体内的来源。 在涉及（一）气管切开术，以确保麻醉过深，防止液体刺激5-7的心愿，（二）刺激交感型颈椎节6或犁鼻器5,7的直接插管引进非挥发性气味体内研究英勇麻醉以及（c）开颅手术带或不带额叶消融，以允许电极前进到AOB 6。清醒/行为研究微驱动8-10参与手术植入。总之，这些实验范式是强大的，但非常困难，往往需要麻醉。
<p class ="“jove_content”">有趣的是，一些研究试图保持感官结构和下游的神经回路活体（ 体外 ）外取得了一些成功11-15。因为VNO和AOB之间的连接保持同侧，且由于中线室间隔组织可以在单个半球暴露于含氧的灌流，我们试图开发这样的单半球体外方法来分离这些结构，同时保持其功能性连接。最近，我们成功地实现了这一目标16。该制剂保持VNO和AOB活着和功能上连接至少4两 – 6小时，因为无论是轴突（沿中线软室间隔组织）和AOB较浅<600μm的特征都可以访问的灌流充氧人工脑脊液（学联）。这VNO-AOB 体外制备允许引入控制刺激到VNO通过薄插管，并直接的视觉进入小AOB进行有针对性的电极放置和/或现场荧光显微镜。这种方法是有利的，如果一个人渴望学习这些电路在没有麻醉剂。因为这种方法切断离心连接，它不能很好地适合于查询到AOB功能的离心调制。该VNO-AOB 体外的准备是很难学，但一旦实现产生一个可靠的平台，探讨电路组织，信息处理和神经可塑性在这个强大的感测电路。Protocol
所有实验均按照批准的得克萨斯大学西南机构动物护理和使用委员会的协议，并被选为以尽量减少应激，不适，疼痛经历的实验动物。 1，解剖商会自定义夹层室，小，薄塑料板所需要的最好的结果（ 图1）。提前尝试此协议的建造或取得该室。 2，解剖解决方案准备1升的标准人工脑脊液（ACSF）中的步骤3.22-5.4使用…
Representative Results
取得成功，这种准备需要大量的实践，有几个步骤，在它可能会失败。每个人都应该想到需要很多的尝试取得成功之前。自定义剥离室需要成功完成该协议，并应事先在开始解剖的后期阶段获得。腔室的设计在图1中给出的是足以达到此目的，并且可以由相对廉价的塑料以最小的加工要求。如果一个人没有产生这样的腔容量，本地或在线加工企业可以进行协商，并可以构造室收费。 </p…
Discussion
该VNO-AOB 体外在本协议中所述的制备是一个有用的替代体内5-7和急性现场片17实验AOB函数来麻醉。不像急性AOB切片实验，这也暴露了电路元件的电和光学记录，该制剂保留所有感觉传入和国内AOB连接。尽管这也可以在体内方法所述的麻醉剂，麻醉剂的存在不一定会改变神经功能，即兴奋性/抑制性的平衡，这是在这个和其他的嗅觉电路18，用于信息处理的…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
，F30 DC011673（GFH：NINDS，NIH）和得克萨斯大学西南的启动资金（JPM）：这项研究是由R00 DC011780（NINDS，NIH JPM）的支持。
Materials
| Straight Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Fine Scissors-Straight | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Scissors-Curved | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Scalpel Blades | Fisher Scientific | 3120030 | |
| Straight Carbon Steel Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 35 mm Petri Dish | Fisher Scientific | 08-772-21 | |
| Dissection Chamber | Custom | N/A | See Fig. 1 |
| Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm | Custom | N/A | |
| Dow Corning Silicon Vacuum grease | Fisher Scientific | 146355D | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| #5 Forceps, Biologie Tip | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 0.0045" Polyimide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | EW-45505-00 | |
| 1/16" Tubing | Fisher Scientific | 14-171-129 | |
| Two ton epoxy | Grainger | 5E157 | |
| ValveBank Pressurized Perfusion Kit | AutoMate Scientific | 09-16 | |
| ValveLink digital/manual controller | AutoMate Scientific | 01-18 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | various | |
| KCl | Sigma-Aldrich | various | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | various | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | various | |
| myo-inositol | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | various | |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | various | |
| glucose | Sigma-Aldrich | various |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Doyle, W. I., Hammen, G. F., Meeks, J. P. Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb. J. Vis. Exp. (90), e51813, doi:10.3791/51813 (2014).