Ex Vivo Bereidingen van de Intact Vomeronasal en accessoires bulbus olfactorius
Summary
De muis accessoire reukbol (AOB) is moeilijk te bestuderen in de context van zintuiglijke codering. Hier tonen we een dissectie dat een ex vivo preparaat waarin AOB neuronen blijven functioneel verbonden met hun perifere ingangen, het vergemakkelijken van onderzoek naar de informatieverwerking van de muis feromonen en kairomonen produceert.
Abstract
De muis accessoire olfactorisch systeem (AOS) is een gespecialiseerde zintuiglijke route voor het opsporen van niet-vluchtige sociale geuren, feromonen, en kairomonen. De eerste neurale circuit in de AOS route, genaamd de accessoire reukbol (AOB), speelt een belangrijke rol bij het vaststellen van het geslacht-typisch gedrag zoals territoriale agressie en paring. Dit kleine (<1 mm 3) circuit beschikt over de capaciteit om unieke gedrags-staten, zoals geslacht, spanning en stress van chemosensory signalen in de af-en uitscheiding van soortgenoten te onderscheiden. Terwijl de compacte organisatie van dit systeem biedt unieke mogelijkheden voor het opnemen van grote delen van het circuit gelijktijdig, onderzoek naar sensorische verwerking in de AOB blijft uitdagend, grotendeels te danken aan haar experimenteel nadelig locatie in de hersenen. Hier tonen we een multi-stage dissectie dat de intacte AOB verwijdert in een enkel halfrond van de voorste muis schedel, waardoor een verbindingionen zowel de perifere vomeronasal sensorische neuronen (VSNs) en lokale neuronale circuits intact. De procedure loopt de AOB oppervlak directe visuele inspectie te vergemakkelijken elektrofysiologische en optische opnamen van AOB circuitelementen in de afwezigheid van anesthesie. Bij het inbrengen van een dunne canule in de vomeronasale orgaan (VNO), die VSNs huizen, kan men direct de omtrek bloot aan sociale geuren en feromonen tijdens het opnemen stroomafwaarts activiteit in de AOB. Deze procedure maakt het mogelijk gecontroleerde onderzoeken naar AOS informatieverwerking, die licht kunnen werpen op de mechanismen koppelen feromoon blootstelling aan veranderingen in het gedrag.
Introduction
Sensorische verwerking in de hersenen van zoogdieren omvat meestal meerdere onderling verbonden neuronale circuits, die elk extracten bijzonderheden van sensorische input. In sensorische paden, vroege informatieverwerking is van vitaal belang voor de normale waarneming en gedrag. In het accessoire olfactorische systeem (AOS), het accessoire reukbol (AOB) is de belangrijkste neurale circuit die de sensorische periferie naar downstream structuren die hormonale evenwicht 1,2, agressie 3, en opwinding 4 dicteren. Als zodanig is het verwerken van informatie binnen dit circuit sterk gekoppeld aan veranderingen in het gedrag van dieren.
Het accessoire reukorgaan ligt bij muizen en ratten met de dorsale / staart / posterieure aspect van de belangrijkste reukbol (MOB) onder de dichte, gevasculariseerd rhinal sinus. De AOB ontvangt afferente innervatie van axonen van perifere vomeronasal sensorische neuronen (VSNs) die in de Vomeronasal (VNO) woont, een small blind-ended buis in de voorste snuit net boven het zachte gehemelte. Deze axonen doorkruisen de delicate vel septum weefsel aan de mediale grens van de neusholtes. Verschillende studies hebben AOB neurale reacties gepeild naar bronnen van AOS geuren (zoals muis urine) in vivo gebruik van verdoofde muizen 5-7 of vrij-het verkennen van dieren 8. De heldhaftige verdoofd in vivo studies betrokken (a) tracheotomies diepe narcose te waarborgen en te voorkomen dat de aspiratie van vloeistof stimuli 5-7, (b) stimulatie van het sympathische ganglion cervicale 6 of directe cannulatie van de Vomeronasal 5,7 tot vluchtige geuren introduceren en (c) craniotomies met of zonder frontale kwab ablaties aan elektrode ontwikkelingen mogelijk te maken in de AOB 6. Awake / gedraagt studies 8-10 betrokken chirurgische implantatie van een Microdrive. Kortom, deze experimentele paradigma's zijn krachtig, maar zeer moeilijk en vereisen vaak anesthesie.
<p class = "jove_content"> Interessant is dat verschillende studies geprobeerd om zintuiglijke structuren en downstream neurale circuits in leven buiten het lichaam (ex vivo) onderhouden met enig succes 11-15. Omdat de verbindingen tussen de VNO en AOB blijven ipsilaterale en omdat de middellijn septum weefsel kan worden blootgesteld aan zuurstof superfusate in een hemisfeer, wilden wij dit ene hersenhelft ex vivo benadering ontwikkelen deze structuren isoleren behoud van hun functionele connectiviteit. We hebben onlangs in geslaagd dit doel te bereiken 16. Deze voorbereiding houdt beide VNO en AOB levend en functioneel verbonden minstens 4 – 6 uur omdat zowel de axonen (langs de middellijn septum zachte weefsel) en AOB zijn relatief ondiep <600 urn functies die toegankelijk geoxygeneerde kunstmatige cerebrospinale vloeistof (superfused zijn aCSF). Dit VNO-AOB ex vivo bereiding maakt introductie van gecontroleerde stimuli in de VNO via een dunne canule, endirecte visuele toegang tot de kleine AOB voor gerichte plaatsing van de elektroden en / of live-fluorescentie microscopie. Deze werkwijze is voordelig indien men wenst om de circuits te bestuderen in de afwezigheid van anesthesie. Omdat deze benadering doorsnijdt centrifugale verbindingen, is het niet geschikt om onderzoek naar centrifugale modulatie van AOB functie. De VNO-AOB ex vivo voorbereiding is moeilijk om te leren, maar eenmaal bereikt produceert een betrouwbaar platform waarop circuit organisatie, informatieverwerking, en neurale plasticiteit onderzoeken in deze krachtige zintuiglijke circuit.Protocol
Representative Results
Discussion
De VNO-AOB ex vivo voorbereiding beschreven in dit protocol is een nuttig alternatief voor verdoofd in vivo 5-7 en acute live-schijfje 17 experimenten van AOB functie. In tegenstelling tot acute AOB slice experimenten, die ook circuit elementen voor elektrofysiologische en optische opnamen bloot, dit preparaat behoudt alle sensorische afferenten en intra-AOB verbindingen. Hoewel dit kan ook gezegd worden van verdoofde in vivo benaderingen, de aanwezigheid van anesthetica …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) en de UT Southwestern opstarten fondsen (JPM).
Materials
| Straight Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Fine Scissors-Straight | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Scissors-Curved | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Scalpel Blades | Fisher Scientific | 3120030 | |
| Straight Carbon Steel Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 35 mm Petri Dish | Fisher Scientific | 08-772-21 | |
| Dissection Chamber | Custom | N/A | See Fig. 1 |
| Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm | Custom | N/A | |
| Dow Corning Silicon Vacuum grease | Fisher Scientific | 146355D | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| #5 Forceps, Biologie Tip | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 0.0045" Polyimide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | EW-45505-00 | |
| 1/16" Tubing | Fisher Scientific | 14-171-129 | |
| Two ton epoxy | Grainger | 5E157 | |
| ValveBank Pressurized Perfusion Kit | AutoMate Scientific | 09-16 | |
| ValveLink digital/manual controller | AutoMate Scientific | 01-18 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | various | |
| KCl | Sigma-Aldrich | various | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | various | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | various | |
| myo-inositol | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | various | |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | various | |
| glucose | Sigma-Aldrich | various |
Riferimenti
- Bruce, H. M. An exteroceptive block to pregnancy in the mouse. Nature. 184, 105 (1959).
- Bellringer, J. F., Pratt, H. P., Keverne, E. B. Involvement of the vomeronasal organ and prolactin in pheromonal induction of delayed implantation in mice. J Reprod Fertil. 59, 223-228 (1980).
- Bean, N. J. Modulation of agonistic behavior by the dual olfactory system in male mice. Physiol Behav. 29, 433-437 (1982).
- Meredith, M. Vomeronasal organ removal before sexual experience impairs male hamster mating behavior. Physiol Behav. 36, 737-743 (1986).
- Hendrickson, R. C., Krauthamer, S., Essenberg, J. M., Holy, T. E. Inhibition shapes sex selectivity in the mouse accessory olfactory bulb. J Neurosci. 28, 12523-12534 (2008).
- Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2010).
- Tolokh, I. I., Fu, X., Holy, T. E. Reliable sex and strain discrimination in the mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 13903-13913 (2013).
- Luo, M., Fee, M. S., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the accessory olfactory bulb of behaving mice. Science. 299, 1196-1201 (2003).
- Binns, K. E., Brennan, P. A. Changes in electrophysiological activity in the accessory olfactory bulb and medial amygdala associated with mate recognition in mice. Eur J Neurosci. 21, 2529-2537 (2005).
- Leszkowicz, E., et al. Noradrenaline-induced enhancement of oscillatory local field potentials in the mouse accessory olfactory bulb does not depend on disinhibition of mitral cells. Eur J Neurosci. 35, 1433-1445 (2012).
- Ames, A., Gurian, B. S. Electrical Recordings from Isolated Mammalian Retina Mounted as a Membrane. Arch Ophthalmol. 70, 837-841 (1963).
- Flock, A. F., Strelioff, D. Studies on hair cells in isolated coils from the guinea pig cochlea. Hear Res. 15, 11-18 (1984).
- Woodbury, C. J., Ritter, A. M., Koerber, H. R. Central anatomy of individual rapidly adapting low-threshold mechanoreceptors innervating the ‘hairy’ skin of newborn mice: early maturation of hair follicle afferents. J Comp Neurol. 436, 304-323 (2001).
- Llinas, R., Muhlethaler, M. An electrophysiological study of the in vitro, perfused brain stem-cerebellum of adult guinea-pig. The Journal of physiology. 404, 215-240 (1988).
- Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
- Meeks, J. P., Holy, T. E. An ex vivo preparation of the intact mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. J Neurosci Methods. 177, 440-447 (2009).
- Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
- Kato, H. K., Chu, M. W., Isaacson, J. S., Komiyama, T. Dynamic sensory representations in the olfactory bulb: modulation by wakefulness and experience. 76, 962-975 (2012).
- Meeks, J. P., Arnson, H. A., Holy, T. E. Representation and transformation of sensory information in the mouse accessory olfactory system. Nature. 13, 723-730 (2010).
