우리는 세포의 행동을 연구하는 전기 방사 막을 내 micropockets의 제조를위한 기술을보고합니다. 구체적으로, 우리는 PLGA (폴리 (락 티드 – 코 – 글리콜 라이드)) 마이크로 피처 구비 각막 생체 재료 소자의 생산을위한 마이크로 광과 전기 방사의 조합을 설명한다.
각막 문제는 전 세계적으로 삶의 질을 크게 감소 수백만의 사람에 영향을 미친다. 각막 질환 등의 무 홍채 증 또는 스티븐 존슨 증후군과 같은뿐만 아니라 화학 화상이나 방사선 등의 외부 요인에 의한 질병으로 인해 발생할 수 있습니다. 현재 치료법은 (ⅰ) 각막 이식의 사용되며 (ⅱ) 실험실에서 확장되고 캐리어 (예를 들면, 양막)에 전달되는 줄기 세포의 용도; 이러한 치료는 상대적으로 성공하지만, 불행히도 그들은 3-5 년 후에 실패 할 수 있습니다. 설계 및 세부 사항에서의 줄기 세포는 각막에 상주 생리적 환경을 모방 할 새로운 생체 재료 각막 장치를 제조 할 필요가있다. 각막 윤부 줄기 세포는 보그의 벼랑으로 알려진 특정 틈새 시장에서 (각막과 공막 사이에 원형 영역) 윤부에 있습니다. 이 작품에서 우리는이 최첨단 제조 기술 (마이크로 광 및 electrospinn을 결합한 새로운 플랫폼 기술을 개발했다어느 정도 모방 각막 윤부에 멤브레인의 제조를 위해) 보내고. 우리의 멤브레인은 보그의 벼랑이 눈처럼 보호 세포를 제공하는 것을 목표로 인공 micropockets가 포함되어 있습니다.
각막, 눈의 외측 중앙 무혈성 대부분 조직을 비전 일에 관여하는 가장 중요한 조직이다. 각막의 기능을 유지하는 세포의 몇 가지 유형이있다. 각막의 최 상부 층의 두께는 2 층에서 약 5-7 일 수 상피 세포를 포함한다. 이 층은 각막 세에 세균 침입을 방지하고 산소 넷의 입력 할 수 있습니다. 이보고 한 내용 윤부 5,6라고도 각막 주변부에서 (120-150 μm 인 사이즈)와 틈새 또는 지하실에서 각막 상피 거짓말 줄기 세포. 줄기 세포 분할로서, 또한 과도 증폭 셀이라고도 딸세포는 틈새 밖으로 이동하고 부서 세포 심적 안쪽으로 이동 및 위쪽 중심 각막 영역에서 7,8 말단 분화 세포에서 얻어진 계속된다. 이 세포는 정기적으로 눈 전자의 깜짝 멀리 닦아 아르구 아래에 새로운 세포를 xposing.
상피 줄기 세포의 위치 일뿐만 아니라, 또한 윤부 각막 영역 (10)로부터 떨어진 혈관 결막을 유지하는 역할을한다. 윤부 손상은 열 / 화학적 화상, 방사선 및 유전 적 질병 (10)에 의해 발생할 수 있습니다. 이 경우, 배리어는 윤부, 결막 세포는 각막에 이동할 수 있도록 영역 신생 혈관, 어떤 경우에는 통증 및 시력 상실을 유발로 세분화된다. 조건은 각막 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD) (10)로 알려져있다.
다른 자연 기판은 각막 재생을 돕는 가능한 줄기 세포 사업자로보고되고있다. 예를 들어, 콜라겐 계 막은 Dravida 외. 11, 라마 및 동료 (12)에 의해 112 환자 연구에서 섬유소의 사용을보고 하였다. 치료의 본 그러나 가장 널리 사용되는 방법에서,표면 (13, 14)에 조직 은행과 문화 윤부 상피 세포에서 인간의 양막을 사용하는 것입니다. 단층이 형성되면, 양막은 수술 이전에이 세포 이식 (14)에서 제거 모든 결막 세포와 흉터 조직이 손상된 각막에 최대 셀 측 붙어있다. 양막 상피 세포 (15, 16)를 재생하는 무 결함 영역에 부착 된 상피 세포를 떠나 개월 주 이내에 저하됩니다. 이 기술은 그러나 임상 적으로 널리 섭취를 제한하는 몇 가지 실질적인 문제가 여전히 거기에 비전을 복원에 성공했다. 양막은 인체 조직이기 때문에이 환자에 대한 세포 이식에 사용되기 전에 좋은 조직 은행 프로 시저를 사용하여 심사 받아야 할 필요가있다. 이 스크리닝은 질환의 전파의 위험성을 낮춘다하지만 완전히 17을 없앨 수 없다. 이 외에도 P 가변성의보고가 있었다때문에 간 기증자의 변화 (18, 19) 및 다른 처리 방법 (19, 20)에 양막의 erformance. 질병 전파의 위험 부담과 함께 수술 센터는 모든 사용할 수 없습니다 잘 실행 조직 은행에 액세스 할 수 있어야 할 필요가있다.
양막은 비교적 성공적이지만, 각막 질환의 치료를위한 새로운 합성 생분해 세포 담체 대안의 개발에 대한 필요성이 존재한다. 캐리어는 합성 절차 뱅킹뿐만 아니라 질병 전파 간 도너 변동의 작은 위험을 제거하기위한 필요성을 극복한다. 이러한 의미에서, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (21, 22)와 PLGA 23,24 같은 재료가 연구되어왔다.
양막을 합성 대안 개발 희망 배양 된 세포의 생존을 도와 그것에 바람직한 특성을 설계 할 수있는 가능성도있다. 포함셀의 동작 제어를위한 특정 장치 내의 생체 재료의 마이크로 피처 lusion 관심 신흥 영역이다. 인공 줄기 세포의 개발이 25 ~ 30을 틈새 시장으로 많은 저자는 작품을보고있다. 이 그룹은 최근 윤부 상피 세포 (22)의 전달 및 각막 윤부 상피 세포 (31)의 지원을위한 미세 포켓이 포함 된 전기 방사 된 생분해 성 막 제작을위한 방법론에 대한 미세 PEGDA의 피브로넥틴-biofunctionalized 인공 각막 윤부의 생성을보고했습니다.
이 연구의 목적은 정도로 세포 체내에 존재하는 줄기 미세 환경을 모방 마이크로 피처를 포함하는 바이오 물질 장치의 개발을위한 새로운 제조 기술을 개발하는 것이다. 우리는 GREA 표시 생분해 미세 막의 제조를 허용 마이크로 광과 전기 방사를 결합하는 기술을 개발했다조직 재생 응용 프로그램에 대한 t 가능성.
이는이 연구에서이 기법은 각막 재생을위한 링의 제조에 적용되었지만, 기술은 상피 조직의 넓은 범위의 재생, 즉, 피부, 구강위한 장치의 제조에 적용 할 수 있음을 주목하는 것이 중요 점막, 소장, 호흡기, 방광 상피. 특히, 본 연구에서 우리는 각막에 세포를 전달하는 양막 유사한 방식으로 기능하는 합성 생분해 성 멤브레인을 개발했다. 이 멤브레인은 약 300 μm 인 micropockets 포함 ((큰 보그의 Pallisades의 윤부 지하실 이상을 약 150 μm의)). 마지막으로, 우리는 이러한 세포막이 파괴의 흔적을 표시하지 않고 6 개월 이상 -20 ° C에서 보관 할 수있는 포장 프로토콜을 설립했다.
이 연구는 그 안에 마이크로 피처를 포함하는 전기 방사 막의 제조 방법과 진공 포장, 감마 방사선 조사 후 저장은 사용하기 전에 임상 사용을 위해 이러한 세포막을 준비하는 (B)에 대한 () 기술에 대해 설명합니다. 이 특정 응용 프로그램에서 우리는 각막 윤부 줄기 세포 틈새의 신체적 특징을 모방 micropockets를 포함하는 PLGA 멤브레인을 개발했다. 이 연구의 목적은 (i)는 조직 재생 그리고 (ii) 더 나은 이해를 제공하기로 줄기 세포 틈새의 기여에 대한 연구를위한 마이크로 피처를 포함하는 발판을 설계하고 제작하는 데 필요한 지식을 독자들에게 제공하는 방법을 설명한다 의 오랜 시간 동안 전기 방사의 발판을 저장하는 방법에 대해 설명합니다.
임상 응용의 측면에서, 링 막의 저장 매우 중요하다. 이 연구에서, 링의 저하는 6 개월 동안 조사 하였다. 의 저하멤브레인은 단순히 수분이없는 프로세스가 정지 막을 수 있도록 유지하여 가수 분해에 의해 구동된다. 사부는 외. PGA로 PLA의 비율을 변화시킴으로써, 막의 열화를 32으로 변경되었다고보고. 이 연구는 또한 PGA의 양을 증가시킴으로써, 전기 방사 막의 열화 속도가 생체 내 (22)에 증가 된 것으로 나타났다. 여기 진공 일부 건조제와 함께 막을 패킹을 조사하고, 6 개월 동안 저온에서 이들을 저장하여, 섬유의 무결성 열화에 변경이없는 것으로 밝혀졌다. 현재, 6 개월까지 우리가 일년이 -20 ° C (22)에서 일반 전기 방사 막에보고 지금 우리가 -20 ° C에서 자신의 저장되지 않은 데이터가되었습니다 이러한 막은 micropockets하지만, 저장 데이터를 포함과 함께 공부 같다 저하의 흔적이없는 이년합니다. 따라서 장기간 보관 -20 그들을 건조를 저장할 권장 될6, C 있지만 (아마도 더 이상) 6 개월 이상에도 인도 RT에서 보관하는 것이 가능하다. 습도 표시 등의 포함은 포장이 그들이 목적에 맞는 될 경우 건조 세포막을 유지하고 있음을 확인하는 쉬운 방법을 제공합니다.
micropockets 내에서 윤부 이식편을 배치 할 때 3D 각막 모델이 링에서 세포의 이동을 표시했다. 이 그룹은 최근 일반 PLGA 막 (고리 구조가없는 막) 24에 외식을 배치하여 체외 토끼 각막 모델 상 세포의 이동을보고했다. 본 미세 지지체 셀 전송을 사용하여 우리가 지금 구체적으로 마이크로 피처 내에서 조직 절편을 찾을 수있는 한 단계를 촬영하고있다. 틈새 내에 직접 이식편을 배치 할 수있는 능력은 또한 외과 의사가 먼저 윤부 줄기 세포를 확장하는 클린 룸의 필요성을 회피 수술 극장에서 직접 멤브레인을 사용할 수있다. 법과이 조각 있지만K가 각막 질환 장치의 개발에 집중되어,이 미세 가공 기술은 또한 다른 많은 응용을위한 장치를 개발하기 위해 적용될 수있다. 향후 연구는 피부와 뼈 등 다른 조직의 재생을위한 구조의 제작을 모색 할 것입니다.
PEGDA 미세 구조의 설계와 초기 제조 시간이 걸릴 수 있습니다 동안, 한 번 구조 저하없이 여러 번 재사용 할 수있는 제조. 따라서, 전기 방사에 의한 미세 구조화 PLGA 생분해 막의 후속 제조는 집 전체의 무지 다음 조립체 ( '비정형') 멤브레인의 제조에 필적하는 속도로 수행 될 수있다. 본 연구에서 우리는 금형을 제조하는 마이크로 광을 사용하고 있지만, 이러한 3D 인쇄 또는 사출 성형 같은 다른 제조 방법도 사용될 수있다. 따라서, 기본 틀은 PE 대신 다른 중합체 또는 금속으로 만들어진 수GDA. 따라서이 기술은 매우 다양합니다 연구원은 쉽게 자신의 필요와 시설에 맞는 방법을 적용 할 수 있습니다.
30μm에서 기능과 구조의 제조를 허용하지 않습니다 본 연구에 사용 된 사내 마이크로 광 설정해서; 이것은 여기에 설명 된 각막 애플리케이션 한정되지이지만 다른 모델의 디자인에 결정적 일 수있다. 그 경우 다른 기술에서와 같은 2 광자 중합 (2PP)는하지만 전기 방사 기술은 (이 현재 우리 그룹에 의해 연구되고있다) 서브 – 미크론 규모의 구조의 재생을 허용하지 않을 관심이있을 수있다.
제조 공정 내에서 중요한 단계는 시간과 광개시제의 양을 조절하여 제어 할 수 PEGDA 템플릿의 overcuring 방지 (I)이다. (ⅱ)와 같은 온도 및 습도와 같은 전기 방사 조건을 제어한다. (ⅲ) 적절한 electrospu 보관진공 포장 및 건조제를 사용하여 n 개의 링 막.
요약하면, 멤브레인의 마이크로 피처 내에서 윤부 조직 절편을 배치하여 우리는 토끼 부상 각막과 각막의 이후의 재 상피화에 틈새 영역, 셀 전송의 절편에서 세포 부산물을 보여 주었다. 다른 온도에서 저장 막의 열화도 검토되고 있으며, 멤브레인의 장기 저장을 허용하는 장비 프로토콜은 임상 사용을위한 멤브레인을 개발 필수적인 것으로, 후자 개발되었다.
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.
Name of reagents/material/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Poly lactic-co-glycolic acid | Purac | PDLG5004 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser |
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250g/mol 500 ml |
DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
Ham’ s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
EGF | R&D | 236-EG-200 | |
Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
gamma- irradiation (Sterilisation) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) – external dose range of 25-40KGy | N/A | |
Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
Copper (II) sulphate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
Scanning Electron Microscopy (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | N/A | |
Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | N/A | |
Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | N/A | 3% |