Biz hücre davranışlarını incelemek için hangi electrospun zarlar içinde mikrocepler imalatı için bir teknik rapor. Özellikle, PLGA (poli (laktid-ko-glikolid)) microfeatures ile donatılmış kornea biyomalzeme cihazların üretimi için microstereolithography ve üretebilmektedir bir kombinasyonunu tarif eder.
Kornea sorunlar tüm dünyada yaşam kalitesini önemli ölçüde azaltarak milyonlarca insanı etkilemektedir. Kornea hastalığı gibi Aniridi veya Steven Johnson Sendromu gibi gibi kimyasal yanıklar ve radyasyon gibi dış etkenlerden hastalıklardan kaynaklanabilir. Mevcut tedaviler, (i) korneal greft kullanımı olup, (i) laboratuarda genişletilmiş ve taşıyıcılar (örneğin, amniyotik membran) teslim kök hücre kullanımı; Bu tedaviler nispeten başarılı olan ama ne yazık ki 3-5 yıl sonra başarısız olabilir. Tasarımı ayrıntılı olarak kök hücreler kornea ikamet fizyolojik ortamının taklit edebilen yeni bir biyo materyal kornea cihazların üretimi için, bir ihtiyaç vardır. Limbal kök hücreler Vogt Palisades'de olarak bilinen özel nişler (kornea ve sklera arasındaki dairesel alan) limbusta bulunmaktadır. Bu çalışmada iki kesim-kenar üretim teknikleri (microstereolithography ve electrospinn birleştiren yeni bir platform teknolojisini geliştirdikbir ölçüde limbusa taklit kornea zarların imalatı için) ing. Bizim membranlar Vogt Palisades göz gibi koruma hücreleri sağlamayı hedefliyoruz yapay mikrocepler içerir.
Kornea, gözün avasküler merkezi en dış doku, görme 1 'de yer en önemli dokuların biridir. Kornea işlevini korumak çeşitli hücre türleri vardır. Korneanın en dış tabaka kalınlığı 2 ile ilgili olarak 5-7 kat olabilir epitel hücreleri içerir. Bu katman, kornea 3 içine bakteri istilasını engeller ve oksijen 4 girişine izin verir. Bu rapor edilmiştir limbusu 5,6 olarak bilinen kornea periferal bölgesinde (120-150 um boyutundaki) niş ve kript kornea epitel yalan kök hücreleri. Kök hücre bölünmeleri, aynı zamanda geçici yükseltme hücreleri olarak bilinen yavru hücre nişler dışına seyahat gibi bölünme hücreler sentripetal içeriye doğru hareket ve Çoklu santral kornea bölgede 7,8 de terminal olarak farklılaşmış hücreler elde ediyor. Bu hücreler rutin göz e açıp kapayıncaya ile sildi edilir9 altında yeni hücreleri xposing.
Epitel kök hücrelerin yer olmanın yanı sıra, aynı zamanda kenar şeridi kornea bölgesinin 10 uzak vaskülarize konjonktiva tutulmasında önemli bir rol oynar. Limbusa hasar termal / kimyasal yanıklar, radyasyon ve genetik hastalıklar 10 neden olabilir. Bu durumda, Limbustan bariyer, konjonktiva hücre kornea üzerine taşımak için izin bölgeyi vascularizing, bazı durumlarda ağrı ve körlüğe neden bozuldu. Durum limbal kök hücre yetmezliği (LSCD) 10 olarak bilinir.
Farklı doğal substratlar kornea rejenerasyonuna yardımcı maksimum kök hücre taşıyıcılar olarak bildirilmiştir. Örneğin kolajen-bazlı membranlar Dravida ve ark. 11 Rama'nın ve çalışma arkadaşları tarafından 12 112 hasta ile yapılan bir çalışmada, fibrin kullanımını rapor kullanılmıştır. Mevcut tedavi, ancak en yaygın olarak kullanılan yöntem deyüzeyinde 13,14 üzerinde bir doku bankası kültür ve limbal epitel hücrelerinden insan amniyotik zar kullanmaktır. Bir tek tabakalı oluştuktan sonra, amniyotik membran cerrahi öncesinde bu hücre nakli 14 ondan kaldırıldı tüm konjonktiva hücreleri ve skar dokusu hasarlı kornea üzerine kadar hücre tarafı yapıştırılır. Amniyon zarı epitel 15,16 yenilemek için soyulmuş alana bağlı epitel hücreleri bırakarak haftalar ve aylar içinde düşürür. Ancak bu teknik, klinik olarak yaygın alımını kısıtlamak, bir kaç pratik sorunlar hala var vizyonunu yeniden başarılı olmuştur. Amniyotik membran insan dokusu olduğu gibi hastalarda hücre nakli için kullanılmadan önce iyi doku bankacılık prosedürleri kullanılarak tarama geçmesi gerekiyor. Bu tarama, sadece hastalıkların bulaşma riskini azaltır ama tamamen o 17 yok edemez. Buna ek olarak p değişkenlik raporlar bulunmaktadırnedeniyle arası donör varyasyon 18,19 ve farklı işleme yöntemleri 19,20 ile amniyotik membranın performansı alabilirsiniz. Hastalık bulaşma riski küçük yanında cerrahi merkezleri hepsi için geçerli değil de işletilen doku bankaları, erişimi için gereksinim yoktur.
Amniyotik membran göreceli olarak başarılı olsa da, kornea hastalığının tedavisi için yeni sentetik biyolojik olarak parçalanabilir bir taşıyıcı hücre alternatifler geliştirilmesi için bir ihtiyaç vardır. Sentetik taşıyıcılar prosedürleri bankacılık yanı sıra hastalık bulaşması ve inter-donör değişkenlik küçük riskini ortadan kaldırmak için ihtiyaç aşmak olur. Bu anlamda, bu tür polietilen glikol 21,22 ve 23,24 PLGA gibi maddeler incelenmiştir.
Insan amniyotik zara sentetik bir alternatif geliştirilmesinde umutla kültürlenmiş hücrelerin hayatta kalma yardımcı içine istenen tasarım özellikleri olasılığı da vardır. Inchücre davranışı belirli kontrolü için biyomalzeme cihazlar içinde microfeatures bir ham hayal ilgi gelişmekte olan bir alandır. Yapay kök hücrelerin gelişimi 25-30 nişler doğru Birçok yazar çalışmalarını bildirdi. Bu grup, son zamanlarda, limbal epitel hücrelerinin 22 teslim ve epitel hücreleri, limbal 31 desteklenmesi için mikrofabrike cepleri ihtiva eden biyolojik olarak parçalanabilir bir electrospun zarların üretimi için kullanılan bir yöntem için bir mikrofabrike PEGDA fibronektin biofunctionalized yapay limbusun oluşturulmasını rapor etmiştir.
Bu çalışmanın amacı, bir ölçüde hücreler vücutta bulunan kök olduğu mikroçevrelerde taklit microfeatures ihtiva eden biyo-malzeme cihazların geliştirilmesi için yeni bir üretim teknolojisinin geliştirilmesidir. Bu veric gösteren biyolojik olarak parçalanabilir bir mikrostrüktürlü zarların imalat sağlar ve elektrospinning microstereolithography birleştiren bir teknik geliştirdilerdoku rejenerasyonu uygulamalar t potansiyeli.
Bu, bu çalışmada bu teknik, kornea yenilenme halkalarının imalatı için uygulanmış olsa da, teknoloji epitelyal dokuların geniş bir rejenerasyonu, örneğin, deri, ağız için cihazların imalatı için tatbik edilebilir olduğunu fark etmek önemlidir mukoza, bağırsak, solunum ve mesane epitel. Spesifik olarak, bu çalışmada, kornea hücreleri sunmak için amniotik zara benzer bir şekilde işlev gören bir biyo-bozunabilir sentetik zar geliştirdik. Bu membran yaklaşık 300 um mikrocepler içerir ((büyük Vogt Pallisades bir limbal crypts 150 civarında mikron)). Son olarak, bu membranların bozulma görülmeksizin fazla 6 ay boyunca -20 ° C de saklanmasını sağlayan bir ambalaj protokolunu oluşturmuşlardır.
Bu çalışma, içlerinde ihtiva microfeatures electrospun zarların imalat ve nasıl vakum ambalaj, gama ışıması ve daha sonra depolama, kullanımdan önce, klinik kullanım için bu tür membranlar hazırlamak için (b) (a) bir yöntem açıklanır. Bu özel uygulama biz limbal kök hücre nişler fiziksel özelliklerini taklit mikrocepler içeren PLGA zarlarını geliştirdik. Bu çalışmanın amacı, (i) doku rejenerasyonu ve (ii) daha iyi anlaşılması ile okuyucuya sunmak için kök hücre nişler katkýya araştırma için microfeatures içeren iskeleleri tasarım ve imal için gerekli bilgi ile okuyuculara sunmak yöntemlerini tanımlamak için vardır süresi uzun süreler boyunca electrospun iskeleleri saklamak için nasıl.
Klinik uygulama açısından, halka zarların depolama büyük önem taşımaktadır. Bu çalışmada, halkanın bozulması 6 aylık bir süre boyunca çalışılmıştır. Parçalanmazarları sadece nemsiz işlemi durdurulur membranlar tutarak çok hidroliz ile tahrik edilir. Blackwood et al. PGA için PLA oran değiştirilerek, membranın bozulması 32 değiştirir bildirmiştir. Bu çalışma ayrıca, PGA miktarının arttırılmasıyla, electrospun membran bozulma oranı, in vivo 22 artış göstermiştir. Burada vakum bazı kurutucu ile birlikte membranlar, paketleme ve onları aydınlatma ve 6 ay boyunca düşük sıcaklıklarda saklayarak ile, lif bütünlüğü ve yıkımı hiçbir değişiklik olmadığını gösterilmiştir. Şu anda, 6 ay kadar biz 1 yıl, -20 ° C'de 22 de düz electrospun zarlarında rapor ve şimdi -20 ° C'de depolanması için yayınlanmadı verilere sahip olmuştur bu membranlar mikrocepler ancak depolama verilerini içeren okumuş gibidir herhangi bir bozulma belirtisi olmadan 2 yıl boyunca. Böylece uzun süreli depolama için -20 onları kuru saklamak için tavsiye edilebilir6 C ama (muhtemelen daha uzun) en az 6 ay için daha da Hindistan oda sıcaklığında saklayın mümkündür. Bir nem göstergesi dahil ambalaj onlar amaca uygun olacak, bu durumda kuru zarları muhafaza ettiğini kontrol kolay bir araç verir.
Mikrocepler içinde limbal eksplantlarını verirken 3D kornea modelleri bu halkaları hücrelerinin transferi gösterilmiştir. Bu grup, en son düz bir PLGA membranlar (halka yapıları olmadan membranlar) üzerinde eksplantların 24 yerleştirerek bir in vitro tavşan kornea modeli üzerine hücre transferi bildirilmiştir. Mevcut mikrofabrike iskeleleri hücre aktarımını kullanarak biz şimdi özellikle microfeatures içindeki doku eksplantlarını bulmak gibi bir adım daha atılmıştır. Nişler içinde doğrudan eksplantlarının yerleştirmek için yeteneği de cerrah ilk limbal kök hücreleri genişletmek için bir temiz oda ihtiyacı kaçınarak cerrahi tiyatro doğrudan membranlar kullanmanıza olanak sağlar. Kel bu parça olmasına rağmenk, kornea hastalığı için cihazların geliştirilmesinde üzerine odaklanmıştır, bu mikroimalat teknolojisi, aynı zamanda pek çok diğer uygulama için cihazlar geliştirmek için de uygulanabilir. Gelecekteki çalışmalar gibi deri ve kemik gibi diğer dokuların yenilenmesi için yapıların imalat inceleyeceğiz.
PEGDA mikroyapıların tasarımı ve ilk fabrikasyon zaman alıcı olabilir iken, bir kez yapıların bozulma olmadan birçok kez tekrar edilebilir fabrikasyon. Bu nedenle, elektroeğirme PLGA mikrostrüktür biyolojik olarak parçalanabilir bir membran daha sonra imalat kollektörün montajından sonra düz ('yapılandırılmamış') zarların üretimi için benzer bir hızda gerçekleştirilebilir. Bu çalışmada, çok kalıpların imal edilmesi için microstereolithography açıklanmasına rağmen, örneğin 3D-baskı veya enjeksiyon tipi kalıplama gibi başka üretim yöntemleri de kullanılabilir. Bu duruma göre, temel kalıp PE yerine diğer polimerler ya da metallerden yapılabilmektedirGDA. Gibi, bu tekniği çok yönlü ve araştırmacılar kolayca kendi ihtiyaçları ve imkanları maç yöntemini uyarlayabilirsiniz.
30uM altında özelliklere sahip yapıların hazırlanmasını izin vermez, bu çalışmada kullanılan içi microstereolithography kurulum; Bu Burada anlatılan kornea uygulama için bir sınırlama değil ama diğer modellerin tasarımında önemli olabilir. Bu durumda diğer teknikleri gibi 2 foton polimerizasyon (2PP) Ancak elektro tekniği (bu şu anda bizim grup tarafından incelenmiştir ediliyor) alt-mikron ölçekte yapıların çoğalmasını izin vermeyebilir ilgi olabilir.
Üretim sürecinde kritik adım ve zaman foto-başlatıcı miktarları ayarlanarak kontrol edilebilir PEGDA şablonlarının overcuring kaçınmak (i). (Ii) bu sıcaklık ve nem gibi elektro koşullarını kontrol. (Iii) uygun bir şekilde saklanması electrospuvakum ambalaj ve kurutucu kullanarak n halka membranlar.
Özet olarak, membranın microfeatures içinde, limbal doku eksplantlarında yerleştirerek bir tavşan kornea yaralı ve korneanın yeniden epitelizasyonunu sonra üzerine hücresi alanları, hücre transfer eksplantlar hücre büyümesinin göstermiştir. Farklı sıcaklıklarda saklandı zarların bozulması üzerine de çalışmalar yapılmış ve membranlar, uzun süreli depolama izin veren bir paket protokol, klinik kullanım için membranlar geliştirilmesinde önemli olmakla, ikinci geliştirilmiştir.
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.
Name of reagents/material/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Poly lactic-co-glycolic acid | Purac | PDLG5004 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser |
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250g/mol 500 ml |
DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
Ham’ s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
EGF | R&D | 236-EG-200 | |
Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
gamma- irradiation (Sterilisation) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) – external dose range of 25-40KGy | N/A | |
Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
Copper (II) sulphate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
Scanning Electron Microscopy (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | N/A | |
Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | N/A | |
Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | N/A | 3% |