Analyse métabolomique de cerveau de rat par la Résolution nucléaire Haute spectroscopie par résonance magnétique d'extraits de tissus

Summary

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

Abstract

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

Introduction

Les modèles murins ont été utilisés largement dans la recherche du cerveau ^1. Corrélation génotype-phénotype ont été étudiés dans le cerveau de souris et de rats par l'étude de l'expression des gènes à l'ARN et / ou les taux de protéine, d'une part, et les phénotypes morphologiques, fonctionnelles, électrophysiologiques et / ou du comportement de l'autre ^6.2. Toutefois, pour bien comprendre les mécanismes liant phénotype génotype, il est impératif d'enquêter sur les événements moléculaires en aval de l'expression des protéines, c'est à dire. le métabolisme des substrats biochimiques des enzymes qui agissent sur ^​​7. Cette exigence a conduit, au cours des 10 à 15 dernières années, à une renaissance de la recherche métabolique dans de nombreuses branches de la biologie ^8,9. Alors que les études métaboliques classiques ont souvent été axées sur les détails de voies spécifiques, la nouvelle approche métabolomique est orientée vers une enquête englobe tout du profil métabolique global du tissu à l'étude.Une conséquence de ce concept est une nécessité évidente pour les outils d'analyse qui minimisent biais en faveur des voies et / ou classes de composés métaboliques spécifiques. Cependant, un dosage biochimique classique est basé sur une réaction chimique particulière d'un analyte spécifique qui doit être déterminée avant le dosage est effectué. En revanche, les techniques spectroscopiques telles que la résonance magnétique (RMN) nucléaire et la spectrométrie de masse (MS) (i) sont basés sur certaines moléculaires propriétés (physiques) des composés biochimiques, dont chacune donne lieu à une ou plusieurs signaux distincts dans un spectre détectées au cours d'une expérience; et (ii) détecter un grand nombre de composés différents par expérimentation.

Ainsi, chaque spectre contient les informations combinées de toute une série de métabolites. Pour cette raison, les méthodes spectroscopiques sont des outils appropriés pour la métabolomique, comme aucune sélection préalable doit être faite en ce qui concerne la nature de l'analyte à mesurer ^huit </sup>. En conséquence, ces techniques se prêtent naturellement à des études exploratoires car ils facilitent grandement la détection de changements métaboliques inattendues.

Bien que la spectroscopie RMN et MS peuvent être utilisés indifféremment pour l'analyse de nombreux métabolites, chaque méthode présente des avantages et des inconvénients qui ont été récemment examinés ¹⁰ spécifiques. En bref, la spectroscopie RMN peut généralement être effectuée à partir des extraits bruts et ne nécessite pas la séparation chromatographique de composés de l'échantillon avant l'analyse. En revanche, MS fonctionne avec du gaz ou la chromatographie liquide (GC ou LC) séparation, sauf pour certains développements récents tels que l'imagerie par spectrométrie de masse. Dans quelques cas particuliers, tels que l'analyse des sucres, la séparation des cristaux liquides peut devenir une nécessité pour la spectroscopie RMN et, car les lignes de résonance des différents sucres se chevauchent de manière significative au proton ⁽¹ H) Les spectres de RMN. Néanmoins, ¹ H spectroscopie RMN sans chrséparation omatographic reste la méthode la plus populaire métabolomique, presque universellement appliquée RMN. En général, la préparation de l'échantillon est plus longue et complexe pour MS que pour la spectroscopie RMN. Problèmes graves en raison des effets de matrice sont beaucoup moins fréquents en spectroscopie RMN que dans les États membres où elles peuvent conduire à des signaux considérablement atténués. Métabolite quantification peut être réalisée avec les deux méthodes. Cependant, plusieurs types de composés sont nécessaires pour la MS en raison de variations dans les effets de matrice et de l'efficacité d'ionisation entre les métabolites. En revanche, une seule norme par échantillon est nécessaire pour une analyse spectroscopique RMN car dans des conditions de mesure appropriés, la dernière méthode est intrinsèquement grâce quantitatives à la réponse RMN strictement linéaire par les noyaux observés. Un inconvénient majeur de RMN est sa sensibilité relativement faible. MS, en particulier LC-MS, est plus sensible que la RMN de plusieurs ordres de grandeur; pour cette raison, la SEP est préférable à la RMN pourl'analyse des composés d'origine à des concentrations très faibles. D'autre part, la nature non destructive de l'expérience de RMN est un net avantage sur MS; de cette façon, la RMN peut être effectuée plusieurs fois sur le même échantillon, par exemple, pour les différents noyaux de RMN-actifs tels que le ¹ H, du phosphore 31 ⁽³¹ P), le carbone 13 ⁽¹³ C), du fluor 19 ⁽¹⁹ F) etc., étant donné qu'aucun produit est consommé par RMN, par opposition à des mesures de sclérose en plaques.

Les deux RMN et MS peuvent être utilisés dans des modes différents, chacun d'eux étant optimale pour la détection de composés possédant des caractéristiques chimiques. Par exemple, ³¹ P RMN est souvent mieux que ¹ H RMN pour l'analyse de composés phosphorylés modérément concentrée, bien que presque tous les métabolites phosphorylés contiennent également des protons. Cependant, leurs signaux RMN ¹ H peuvent être masquées par ^une signaux H RMN d'autres composés, non phosphorylés, tandis que le secondévidemment pas provoquer un bruit de fond dans ³¹ spectres RMN P. Dans une situation analogue, ¹⁹ F analyse RMN est préférable pour les composés fluorés, par exemple, les médicaments fluorés (pas de signaux de fond de métabolites endogènes), tandis que le cas particulier de RMN ¹³ C est d'un intérêt presque exclusivement si le sort de ¹³ C précurseurs métaboliques marqués exogènes doivent être suivis, en raison de la très faible abondance naturelle de l'isotope ¹³ C (environ 1%). Beaucoup de spectromètres de masse travaille en mode ion négatif ou en mode d'ions positifs. Par conséquent, il est important de savoir à l'avance si l'analyse des ions à observer sont chargés positivement ou négativement. Nous nous concentrons ici sur un protocole pour l'analyse du métabolome de tissu cérébral par ¹ H et ³¹ spectroscopie RMN P parce que cette méthode donne un grand nombre de concentrations de métabolites importants à faible coût en termes de (i) le temps nécessaire pour la préparation des échantillons d'une (ii) l'effort nécessaire pour le métabolite quantification. Toutes les expériences peuvent être effectuées en utilisant l'équipement d'un laboratoire de chimie par voie humide classique et un centre de la spectroscopie RMN à haute résolution. D'autres exigences sont décrites dans la section ci-dessous de protocole.

Protocol

REMARQUE: l'éthique animale DÉCLARATION Les études animales sur des rats ont suivi les directives en vigueur en France, et ont été approuvés par le Comité local d'éthique (# 40.04, l'Université de l'École de médecine d'Aix-Marseille, Marseille, France). 1. récolte et de congélation de cerveau de rat Préparer les éléments nécessaires: azote liquide (N 2liq.) Dans Dewar qui est suffisamment grande pour maintenir un serrage à la…

Representative Results

Pour obtenir une meilleure résolution dans les spectres RMN métabolique de cerveau et d'autres extraits de tissus, il a longtemps été une pratique courante pour enlever ou ions masque de métal (le plus important: les ions paramagnétiques) présents dans des solutions d'extraction. Ceci a été réalisé soit en ajoutant un agent chélateur tel que l'EDTA ou le CDTA à l'extrait 19, ou par passage de l'extrait à travers une résine échangeuse d'ions telle que Chelex-100 20….

Discussion

La spectroscopie de RMN est une méthode efficace pour mesurer les concentrations des composés chimiques en solution d'une manière très reproductible et précise. Cependant, pour obtenir des données de haute qualité, il est nécessaire de respecter certaines règles concernant la préparation et l'analyse des échantillons. Dans la détermination de concentrations de métabolites par spectroscopie RMN, ni la production ni la réception du signal de RMN domine l'erreur de quantification, à moins que l&#…

Materials

Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15-mL, 30-mL tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2-mL tube; should replace "Eppen-dorf" tube if compatible with centrifuge rotor
polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10-mL volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96 % deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96 % deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20 % in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30 % in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	Ricerca	With tips for volumes from 0.5 to 1000 μL
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be < 70 – 80 % purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913