Metabolomische Analyse von Rattenhirn Hohe Auflösung Kernresonanzspektroskopie von Gewebeextrakte

Summary

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

Abstract

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

Introduction

Mausmodelle sind weitgehend in der Hirnforschung ¹ verwendet worden. Genotyp-Phänotyp-Korrelationen in Maus-und Rattenhirne durch das Studium der Genexpression auf RNA-und / oder Protein-Ebene auf der einen Seite auf die andere ^2-6 untersucht und morphologischen, funktionellen, elektrophysiologischen und / oder Verhaltens Phänotypen. Um jedoch die Mechanismen der Verknüpfung von Genotyp-Phänotyp zu vollständig zu verstehen, ist es unerlässlich, die molekularen Ereignisse hinter der Protein-Expression, dh zu untersuchen. der Stoffwechsel der biochemischen Substrate, auf denen Enzyme wirken ^7. Diese Anforderung führte in den vergangenen 10 bis 15 Jahren, zu einer Renaissance der Stoffwechselforschung in vielen Bereichen der Biologie ^8,9. Während klassische Stoffwechselstudien haben oft auf Details der besonderen Fachrichtungen ausgerichtet ist, wird die neue Metabolomics Ansatz einer umfassenden Untersuchung der globalen Stoffwechselprofil des Gewebes unter Berücksichtigung ausgerichtet.Eine Folge dieses Konzepts besteht ein offensichtlicher Bedarf für analytische Werkzeuge, die Ausrichtung auf bestimmte Stoffwechselwege und / oder Klassen von Verbindungen zu minimieren. Jedoch ist eine klassische biochemische Assays auf eine bestimmte chemische Reaktion eines spezifischen Analyten festgelegt werden, bevor der Test durchgeführt wird, die Bedürfnissen. Im Gegensatz dazu werden spektroskopische Techniken, wie kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR) und Massenspektrometrie (MS) (i) zu bestimmten molekularen (physikalischen) Eigenschaften von biochemischen Verbindungen, bezogen von denen jede zu einem oder mehreren verschiedenen Signale in einem Frequenz im Verlauf eines Experiments erfasst; und (ii) erkennen eine große Anzahl von unterschiedlichen Verbindungen pro Experiment.

So enthält jedes Spektrum die kombinierten Informationen über eine ganze Reihe von Stoffwechselprodukten. Aus diesem Grund, spektroskopische Verfahren sind geeignete Werkzeuge für metabolomics, da keine vorherige Selektion muss gemacht bezüglich der Art des Analyten zu messenden ⁸ </sup>. Als Folge sind diese Techniken natürlich eignen sich für Vorstudien, weil sie den Nachweis von unerwarteten Stoffwechseländerungen erheblich erleichtern.

Obwohl NMR und MS austauschbar für die Analyse von vielen Metaboliten verwendet werden, besitzt jedes Verfahren spezifische Vor-und Nachteile, die vor kurzem wurden bewertet ^10. Kurz gesagt, können NMR-Spektroskopie üblicherweise aus Rohextrakten durchgeführt werden und erfordert keine chromatographische Trennung der Probenverbindungen vor der Analyse erfordert. Im Gegensatz dazu arbeitet MS mit Gas oder Flüssigkeits-Chromatographie (GC oder LC) Trennung, mit Ausnahme insbesondere die jüngsten Entwicklungen wie der Massenspektrometrie Bildgebung. In einigen speziellen Fällen, wie die Analyse von Zucker, kann LC-Trennung eine Notwendigkeit für die NMR-Spektroskopie als auch geworden, weil die Resonanzlinien aus verschiedenen Zuckerarten überschneiden sich in den Proton ⁽¹ H)-NMR-Spektren. Dennoch, ¹ H-NMR-Spektroskopie ohne chromatographic Trennung bleibt die beliebteste, fast allgemein angewandte metabolomische NMR-Methode. Im Allgemeinen ist die Probenvorbereitung zeitaufwendig und komplex für MS, als es für NMR-Spektroskopie. Schwerwiegende Probleme auf Matrixeffekte sind viel in der NMR-Spektroskopie weniger verbreitet als in MS, wo sie deutlich gedämpften Signale führen. Metabolit Quantifizierung kann mit beiden Methoden erreicht werden. Jedoch werden mehrere Standardverbindungen für MS aufgrund von Variationen in Matrixeffekte und Ionisation Wirkungsgrade zwischen Metaboliten benötigt. Im Gegensatz dazu wird nur eine Standard pro Probe für ein NMR-spektroskopischen Analyse, weil unter geeigneten Messbedingungen erforderlich ist, ist das letztere Verfahren eigen quantitative dank der streng linearen NMR-Antwort von den Kernen beobachtet. Ein Hauptnachteil der NMR ist seine relativ geringe Empfindlichkeit. MS, insbesondere LC-MS, ist empfindlicher als NMR um mehrere Größenordnungen; Aus diesem Grund ist MS über NMR für das vorzuziehenAnalyse der Verbindungen in sehr geringen Konzentrationen auftreten. Andererseits ist die zerstörungsfreie Art der NMR-Experiment wird ein klarer Vorteil gegenüber MS; auf diese Weise NMR wiederholt an der gleichen Probe, beispielsweise für unterschiedliche NMR-aktiven Kernen, wie ¹ H, 31-Phosphor ⁽³¹ P), ^{Kohlenstoff-13} (13 C), durchgeführt werden kann, Fluor-19 (F ^19), etc., da kein Material durch NMR verbraucht im Gegensatz zu MS-Messungen.

Sowohl NMR-und MS kann in verschiedenen Modi verwendet werden, wobei jeder eine optimal für den Nachweis von Verbindungen mit bestimmten chemischen Eigenschaften. Zum Beispiel ist ³¹ P NMR oft besser als ¹ H-NMR für die Analyse der mäßig konzentrierten phosphorylierten Verbindungen, obwohl fast alle phosphorylierten Metaboliten Protonen enthalten. Jedoch kann ihre ¹ H-NMR-Signale durch ¹ H-NMR-Signale von anderen, nicht-phosphorylierten Verbindungen verdeckt werden, während die letzterenoffensichtlich nicht dazu führen, Hintergrundsignale in ³¹ P-NMR-Spektren. In einer analogen Situation ist ¹⁹ F-NMR-Analyse für fluorierte Verbindungen, beispielsweise fluorierte Medikamente (keine Hintergrundsignale von endogenen Metaboliten) bevorzugt werden, während der Spezialfall von ¹³ C-NMR von Interesse fast ausschließlich wenn das Schicksal von ¹³ C markierten exogenen metabolischen Vorstufen muss beachtet werden, aufgrund der extrem niedrigen natürlichen Häufigkeit des Isotops ¹³ C (ca. 1%). Viele Massenspektrometer arbeiten entweder in Negativ-Ionen-Modus oder positiven Ionenmodus. Daher ist es wichtig, vor der Analyse, ob die Ionen beobachtet werden negativ oder positiv geladen sein kennen. Wir konzentrieren uns hier auf ein Protokoll für die Analyse von Hirngewebe Metabolom durch ¹ H-und ³¹ P-NMR-Spektroskopie, da dieses Verfahren ergibt sich eine große Anzahl von wichtigen Metaboliten-Konzentrationen bei niedrigen Kosten in Form von (i) der Zeit für die Probenvorbereitung eine benötigtend (ii) Aufwand für Metabolit Quantifizierung erforderlich. Alle Experimente können unter Verwendung der Ausrüstung eines Standard-Nasschemielabor und einen hochauflösenden NMR-Spektroskopie-Anlage werden. Weitere Anforderungen sind in dem Protokoll weiter unten beschrieben.

Protocol

HINWEIS: Tierethik RECHNUNG Tierexperimentelle Studien an Ratten folgten die Leitlinien in Frankreich gültig ist, und wurden von der lokalen Ethikkommission (# 40.04, Universität Aix-Marseille Medical School, Marseille, Frankreich) genehmigt. 1. Ernte und Einfrieren Rattenhirn Vorbereitung erforderlich: flüssiger Stickstoff (N 2liq.) In Dewar, die groß genug, um ein Einfrieren Klemme (mindestens 2-3 l Volumen) zu halten, ist; Narkose (zB Isofluran od…

Representative Results

Um beste Auflösung bei Stoffwechsel NMR-Spektren von Gehirn und anderen Gewebeextrakten zu erhalten, ist es schon lange üblich, zu entfernen oder Maske Metallionen (vor allem: paramagnetischen Ionen) in Extraktlösungen vorhanden. Dies wurde entweder durch Zugabe eines Chelatbildners wie EDTA oder CDTA dem Extrakt 19, oder indem der Extrakt durch ein Ionenaustauschharz, wie Chelex-100 20 erreicht. Die in Abbildung 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass dieser Schritt nicht für …

Discussion

NMR-Spektroskopie ist eine effiziente Methode zur Messung der Konzentration von chemischen Verbindungen in Lösung in einem sehr reproduzierbare und genaue Weise. Allerdings ist, um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten es notwendig, bestimmte Vorschriften für die Probenvorbereitung und Analyse halten. Bei der Bestimmung der Metaboliten-Konzentrationen durch NMR-Spektroskopie, weder die Erzeugung noch der Empfang des NMR-Signals dominiert die Quantifizierungsfehler, sofern die Intensität des beobachteten Signals n?…

Materials

Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15-mL, 30-mL tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2-mL tube; should replace "Eppen-dorf" tube if compatible with centrifuge rotor
polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10-mL volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96 % deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96 % deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20 % in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30 % in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	Ricerca	With tips for volumes from 0.5 to 1000 μL
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be < 70 – 80 % purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913