Miglioramento in gel riduttive solfo-glycomics β-eliminazione completa per O-linked e di spettrometria di massa
Summary
In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive β-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.
Abstract
Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive β-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.
Introduction
La glicosilazione è una proteina post-traduzionale modifica essenziale, contribuendo alla fisiologia organismal, patologia dei tessuti, e il riconoscimento cellulare 1-3. Nonostante i grandi progressi nella glicoscienza analitica, che caratterizza la diversità completa di glicani su una specifica proteina rimane un compito estremamente impegnativo, soprattutto sulle proteine isolate da fonti biologiche primarie. Tuttavia, la microeterogeneità di glicani glicoproteina interessa frequentemente interazioni funzionali con altre proteine. Pertanto, la caratterizzazione della diversità glycan è essenziale per comprendere il significato fisiologico di cellulare e tissutale glicosilazione 4,5. Per comprendere il contributo della glicoproteina glicosilazione alla fisiologia dei tessuti e fisiopatologia, robusto, sensibile, e tecniche analitiche glycomic globali sono diventati sempre più importanti. In analisi proteomica, identificazione di proteine sono in genere raggiunti da LC-MS/ Analisi MS di peptidi triptici 6. Proteina digestione può essere effettuata con una proteina o proteine purificate risolto mediante SDS-PAGE dopo digestione in gel con proteasi quali tripsina 7-9. Pre-arricchimento della miscela proteica mediante SDS-PAGE migliora la profondità e la precisione di ID proteine. Lo sviluppo di strategie analoghe per l'analisi glycomic della glicoproteina glicosilazione si trova in prima linea glicoscienza.
I due principali classi di glicani sono attaccati alla backbone della proteina sia attraverso N-linkage o O-linkage. Glicani N-linked sono collegati a asparagina (Asn) residui presenti come parte di un sequon definita come Asn-X-Ser / Thr / Cys (X è un qualsiasi amminoacido prolina eccezione), e può essere rilasciato per digestione enzimatica con peptide- N -glycanase (PNGaseF o A), sia in soluzione, in gel, oppure on-blot 10-12. Glicani O-linked sono collegate principalmente alla serina (Ser) e treonina (Thr) residui. Tuttavia, solo un enzima è stato idenficato che è in grado di rilasciare glicani O-linked dalla glicoproteina e ha una specificità glicani estremamente limitata, rilasciando solo i semplici glicani O-linked. Strategie di rilascio di sostanze chimiche rimangono il metodo di scelta per il rilascio completo di glicani O-linked da glicoproteine. Β-eliminazione riduttiva o non riduttiva, o idrazinolisi sono tecniche di rilascio chimico ben caratterizzati e sono attualmente i metodi più comunemente usati per il rilascio glicani O-linked da glicoproteine 13,14. Sebbene riduttivo β-eliminazione è stato usato per rilasciare glicani O-linked da glicoproteine separate mediante SDS-PAGE, approcci precedenti necessari separazione HPLC per la successiva analisi 15-17.
Multidimensionale MS (MS n) analisi attualmente fornisce la fonte più ricca di dati strutturali per la caratterizzazione di glicani rilasciati da glicoproteine isolate negli importi previsti dalla maggior parte delle fonti biologiche. La profondità della SMbasata caratterizzazione strutturale è notevolmente facilitata da permethylating i glicani rilasciati prima della loro analisi. Permethylation migliora la ionizzazione e tende a livellare le risposte di segnale molari in una vasta gamma di strutture glycan 18,19. Inoltre, permethylation tag senza ambiguità frazioni monosaccaridi terminali e sostituiti con masse distintivi, rafforzando in tal modo delucidazione strutturale 20-23. Ad esempio, glicani acidi sono generalmente difficili da rilevare come specie non-permethylated da MS. Sebbene glicani acidi possono essere rilevati in modalità ioni negativi da MS, è impossibile rilevare sia glicani acidi e neutri nella stessa modalità ioni. Uno dei principali vantaggi di permethylation glycan è che tutti i gruppi idrossilici liberi (OH) su sostituenti monosaccaridi di un glycan sarà limitato con un gruppo metilico (OCH 3 o OME), in tal modo gli oneri a sialylated di glicani sono neutralizzati, che li rende come rilevabile come permethylated neutro (asiaLO) glicani. Tuttavia, gli idrossili di frazioni solfato di sulfoglycans sono resistenti permethylation, con conseguente ritenzione di carica anionica, che sopprime ionizzazione e diminuisce la sensibilità. Questa soppressione attualmente impedisce un'analisi completa glycomic di glicoproteine molto complessi come mucine, che trasportano una grande abbondanza di glicani solfati 24-26.
Recenti rapporti sulla depurazione solfato glicani hanno usato pagano, cromatografia a fase inversa per purificare e glicani permethylated separati prima dell'analisi MALDI. Questo metodo si basa sulla completa separazione dei glicani solfati e non solfati utilizzando diverse fasi mobili per l'eluizione, che abbiamo trovato ad essere meno rigorosi di organico partizionamento fase. Pertanto, le nuove tecniche adatte per la rilevazione e l'arricchimento di sulfoglycans sono qui presentati. Queste tecniche consentono il recupero quantitativo dei glicani solfatate in fase acquosa segue acqua: DCM (diclorometano)estrazione, che viene normalmente eseguita al termine di reazioni permethylation glycan 27. È importante sottolineare che questo robusto separazione tra sulfoglycans permethylated da una miscela di glicani non solfati permethylated arricchisce in concomitanza per le specie cariche ma anche di semplificare MS 2 modelli di frammentazione. Un protocollo completo per una migliore analisi glicani in gel-O-linked è anche presentato. Il protocollo migliorata migliora il recupero glicani, aumenta le informazioni strutturali ottenibili tramite MS n analisi dei glicani permethylated, e migliora la sensibilità delle analisi sulfoglycomic applicate a glicoproteine essenziali isolati da fonti biologiche.
Questo protocollo è destinato O-glicani legati analisi di estratti glicoproteina interi o di una specifica glicoproteina di interesse risolto mediante SDS-PAGE e si compone di tre procedure sperimentali; A) Gel clean-up, B) in-gel riduttivo β-eliminazione, e C) permethy glycanmento. L'obiettivo è quello di ottenere dati completi O-linked glycomic per glicoproteine raccolti dalle fonti primarie di interesse biologico (Figura 1). Glicoproteine separate mediante SDS-PAGE sono visibili con la colorazione e bande di interesse sono asportato e la band gel risultante viene tagliata a piccoli pezzi. I pezzi di gel sono decolorato e sottoposti a lavaggi acetato di etile per rimuovere i contaminanti gel (Figura 2A). Rilascio Glycan si ottiene in gel riduttivo β-eliminazione (Figura 2B) ed i glicani rilasciati sono permethylated. Acquosa-organico estrazione secondo permethylation partizioni quantitativamente le anionici solfato glicani lontano da glicani neutri non solfati (Figura 2C). Nel gel riduttivo β-eliminazione accoppiato ad estrazione acquoso-organici permette la caratterizzazione di glicani e sulfoglycans O-linked rilasciate da piccole quantità di glicoproteina separati mediante SDS-PAGE. La visione strategica è summarized nella figura 1 ed i dettagli sono mostrati in Figura 2. Inoltre, una parte dei pezzi di gel decolorato e lavati può essere utilizzato per l'identificazione di proteine mediante tecniche di proteomica LC-MS / MS standard.
Protocol
Representative Results
Discussion
Combining in-gel reductive β-elimination with aqueous-organic extraction enhances the sensitivity and depth of structural data that can be acquired for characterizing sulfated and non-sulfated O-linked glycans harvested from small amounts of mucin-type glycoproteins resolved from other proteins by SDS-PAGE. The essential advances of the technical approaches presented in this study are: (a) facile removal of gel derived contaminants by simple washing steps; (b) quantitative recovery of permethylated sulfoglycans in t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the grant P01HL107151 from the NHLBI/NIH. The authors also gratefully acknowledge the support and access to instrumentation provided through grant P41GM103490 from the NIGMS/NIH.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Water, deionized water | Sigma-Aldrich | 270733-4L | CHROMASOLV, for HPLC |
| Acetic acid, Glacial | Fisher | A38-500 | Certified ACS≥99.7 w/w % |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9% |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830-500G | BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1 |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1 |
| Ethyl acetate | Fluka | 34972-1L-R | LC-MS CHROMASOLV, Step 1 |
| Sodium borohydride | Aldrich | 213462-25G | ReagentPlus, 99%, Step 2 |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | ReagentPlus, 99.5%, Step 6. Store at 4 °C until use. Sit at room temperature before use. |
| Sodium hydroxide solution, 50% w/w | Fisher | SS254-1 | Certified, Step 6 |
| Dimethyl sulfoxide, anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855-1L | Anhydrous, ≥99.9%, Step 6 |
| Methanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | Anhydrous, 99.8%, Step 6 |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-4L | CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7 |
| Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh | Sigma-Aldrich | 217506-500G | Step 3 |
| AG 50W-X8 Resin | Bio-Rad | 142-1441 | Step 3 |
| BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase | JT Baker | JT-7020-01 | Step 5 and 8 |
| 7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | Step 1 | |
| Bio-Safe Coomassie Stain | Bio-Rad | 161-0786 | G-250, Step 1 |
| Silver Stain Kit for Mass Spectrometry | Pierce | 24600 | Step 1 |
| Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) | Supelco | 47265 | |
| Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) | Supelco | 47265 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip | VWR | 14673-010 | Wash before use |
| PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-13 | Wash before use |
| PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-16 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-13 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-15 | Wash before use |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81265 | volume 500 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81165 | volume 250 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81065 | volume 100 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 80965 | volume 50 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton Calibrated Syringes | HAMILTON | 80300 | volume 10 μL, needle size 26s ga |
| Petri Dish Glass 100mm x 15mm | GSC INTERNATIONAL INC | 1500-4 | Wash before use, Step 1 |
| Bard-Parker Surgical Blades | Fisher | 371310 | Step 1 |
| Reacti-Therm Heating/Stirring Module | Pierce | 18870 | Step 1, 4 and 7 |
| Heating Blocks | Fisher | 125D | Step 2 |
| Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm | Aldrich | CLS3950 | Step 3 |
| Fused Silica CutterTubing cutter | alltech | 3194 | Step 3 |
| Multi-tube vortexers | VWR | 444-7063 | Step 6 |
| Lyophilizer 25EL Freezemobile | Virtis | 25EL | |
| Centrifuge | VWR | Clinical 50 | |
| LTQ Orbitrap Discovery | Thermo Fisher Scientific | 0 |
Riferimenti
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