Tandem congelación de alta presión y la rápida congelación de sustitución de tejidos vegetales para Microscopía Electrónica de Transmisión

Summary

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Abstract

Dado que el microscopio electrónico de transmisión de 1940 (TEM) ha estado proporcionando los biólogos con imágenes ultra-alta resolución de los materiales biológicos. Sin embargo, debido a los protocolos laboriosos y lentos que también exigen experiencia en la preparación de las muestras libres de artefactos, TEM no se considera una técnica fácil de usar. Preparación de la muestra tradicional para TEM utiliza fijadores químicos para preservar las estructuras celulares. Congelación de alta presión es la criofijación de muestras biológicas bajo altas presiones para producir velocidades de enfriamiento muy rápidas, restringiendo así la formación de hielo, que es perjudicial para la integridad de la ultraestructura celular. Congelación de alta presión y la sustitución de congelación son actualmente los métodos de elección para la producción de la morfología de la más alta calidad en las secciones de resina para TEM. Estos métodos reducen al mínimo los artefactos normalmente asociados con el procesamiento convencional para TEM de secciones delgadas. Después de criofijación el agua congelada en la muestra se sustituye con el líquidodisolvente orgánico a bajas temperaturas, un proceso llamado sustitución de congelación. Sustitución Freeze se lleva a cabo normalmente durante varios días en dedicado, equipos costosos. Una reciente innovación permite que el proceso se completará en tres horas, en lugar de los habituales dos días. Esto es seguido por varios días más de preparación de la muestra que incluye la infiltración y la incrustación en resinas epoxi antes de seccionar. Aquí se presenta un protocolo que combina la congelación de alta presión y la sustitución de congelación rápida que permite la fijación de la muestra planta para llevar a cabo en cuestión de horas. El protocolo puede adaptarse fácilmente para trabajar con otros tejidos u organismos. Los tejidos vegetales son de especial preocupación debido a la presencia de espacios aireados y vacuolas llenas de agua que impiden la congelación sin hielo de agua. Además, el proceso de fijación química es especialmente larga en las plantas debido a las paredes celulares que impiden la penetración de los productos químicos a lo profundo dentro de los tejidos. Los tejidos de plantas son, por lo tanto particcialmente difícil, pero este protocolo es confiable y produce muestras de la más alta calidad.

Introduction

Nuestro conocimiento de la ultraestructura de células proviene principalmente de microscopía electrónica, que puede resolver detalles en el intervalo de unos pocos nanómetros ^1. A pesar de ser tan poderoso en la resolución TEM no se considera fácil de usar, como preparación de la muestra requiere mucho tiempo y protocolos laboriosas, y exige cierta experiencia del practicante. Fijación tradicional de las muestras ha combinado el uso de aldehídos y tetróxido de osmio antes del procesamiento adicional que incluye la deshidratación, incrustación de resina y luego en seccionar para producir secciones ultra-delgada que se tiñen con metales pesados. Sin embargo, se sabe que la fijación química puede producir artefactos incluyendo la agregación de proteínas y la pérdida de lípidos ^1, y cambios a las membranas que afectan en última instancia varios compartimentos celulares ^2. Estos artefactos se atribuyen en gran parte a la lenta tasa de fijación y deshidratación a temperatura ambiente ^{3, 4, 5.}

<p class="Jove_content"> Criofijación por alta presión congelación (HPF) evita la mayoría de los artefactos causados ​​por la fijación química. El principio de criofijación es que disminuye el punto de congelación del agua por 20 grados, se ralentiza la nucleación y crecimiento de cristales de hielo y aumenta la viscosidad del agua en una muestra biológica de modo que los constituyentes celulares son esencialmente inmovilizadas ^{6, 7.} HPF disminuye un la temperatura de la muestra a la de nitrógeno líquido, a muy alta presión (210 MPa o 2.100 bar) en milisegundos. Cuando se hace correctamente HPF previene la formación de grandes cristales de hielo que pueden causar grandes daños a ultraestructura celular. HPF se puede utilizar para fijar muestras de 100-200 micras de espesor en concentraciones típicas de solutos biológicos ^7. Hay numerosas opiniones sobre la física y los principios subyacentes HPF, por ejemplo, ^{1, 7, 8.}

Después de HPF, las muestras se incubaron a temperatura baja (-78,5 ° C a -90 y# 176; C) en presencia de disolvente que contiene fijadores químicos líquidos orgánicos como tetróxido de osmio, generalmente para unos pocos días. A esta baja temperatura, el agua en la muestra se sustituye por el disolvente orgánico, típicamente acetona o metanol ^{1, 9.} Por lo tanto, este proceso se denomina sustitución de congelación (FS). La muestra se calentó gradualmente y durante este tiempo se fija, por lo general con tetróxido de osmio y acetato de uranilo ^9. La reticulación a bajas temperaturas tiene la ventaja de la fijación de moléculas que están inmovilizadas ^1. FS, por tanto, produce muestras de calidad superior en comparación con los fijados por la fijación química convencional a temperatura ambiente, en particular, que resulta en una mejor conservación ultraestructural, mejor conservación de la antigenicidad y la reducción de la pérdida de los componentes celulares no unidas ^{10, 11.}

La mayoría de FS se lleva a cabo durante períodos de tiempo largos, normalmente de hasta varios días. Esto es particularmente true para las plantas muestras ^{12, 13, 14.} Un reciente protocolo desarrollado por McDonald y Webb reduce en gran medida el tiempo de FS desde varios días hasta unas pocas horas ^15. En su procedimiento de rápida sustitución de congelación (QFS), FS se lleva a cabo más de 3 horas, mientras que en el FS súper rápidas (SQFS) muestras se procesan en 90 minutos. La calidad de las muestras producidas por estos métodos es comparables a los generados por los protocolos de FS tradicionales. Hemos adoptado el protocolo QFS para el procesamiento posterior de las muestras de plantas después de HPF. Esto ha demostrado ahorrar no sólo tiempo, sino también dinero, como QFS y SQFS utilizan equipos de laboratorio común en lugar de las costosas máquinas FS disponibles comercialmente.

Los tejidos vegetales son a menudo muy difícil de preparar para TEM. En promedio, las células vegetales son más grandes que cualquiera de las células bacterianas o de animales. La presencia de cutícula cerosa hidrófobo, paredes celulares gruesas, grandes vacuolas llenas de agua que contienen ácidos orgánicos, hidrolasas y c fenólicocomuestos que pueden ocupar hasta el 90% del volumen total de células ^16, y la presencia de espacios aireados disminuye gravemente la conductividad de calor del sistema ^17. Además, en el caso de las plantas, el espesor de la muestra casi siempre supera 20 m, el límite para el uso de la fijación química. En estos espesores, la baja conductividad de calor de agua evita una tasa de congelación más de -10 000 ° C / seg en el centro de la muestra. Se requiere que la tasa para evitar la formación de hielo hexagonal perjudicial (cristales de hielo con una densidad más baja y más grande que de 10 a 15 nm) ^8. Juntos, estos presentan desafíos tanto a congelación adecuada de la muestra y FS posteriores. No obstante, criofijación es el mejor método para la fijación de muestras de plantas. Aquí se presenta un protocolo para HPF-QFS de muestras de tejidos vegetales. Se centra en la especie modelo Arabidopsis thaliana, pero también se ha utilizado con Nicotiana benthamiana. Los resultados típicos demuestran que HPF-QFS produce samples de calidad comparable a la tradicional HPF-FS en una fracción del tiempo. Con los ajustes adecuados, este protocolo puede usarse también para otras muestras biológicas relativamente gruesas.

Protocol

NOTA: El procedimiento QFS requiere extremo cuidado y precaución por el usuario y le prestamos atencion a estas precauciones de seguridad aquí como precauciones y notas en su caso. 1.Preparación para HPF Run Antes de comenzar la preparación de muestras, encienda el congelador de alta presión siguiendo las instrucciones del fabricante. NOTA: La unidad HPF utilizada en este protocolo es una unidad compacta Wohlwend 02 (Figura 1), y se tarda aproximadamen…

Representative Results

Los resultados presentados a continuación han sido obtenidos utilizando un Wohlwend compacto 02 para HPF (Figura 1A). Una gran ventaja de este instrumento es la facilidad de uso de los portadores de muestra y sus titulares. Si se utilizan otros instrumentos, McDonald recomienda que dos usuarios deben llevar a cabo la preparación de la muestra y HPF, una preparación de las muestras, mientras que el otro hace la congelación y traslado al FS crioviales 9. Sin embargo, la Wohlwend espécimen …

Discussion

El éxito del protocolo que se presenta aquí depende en gran medida del usuario. En primer lugar, se requiere una preparación avanzada para asegurar que todos los materiales necesarios son fácilmente disponibles y en cantidad suficiente para completar toda una carrera HPF-QFS. En segundo lugar, el usuario debe trabajar con rapidez, moviéndose desde el paso-a-paso de una manera eficiente que minimiza la manipulación de la muestra, minimizando de este modo los cambios en el estado nativo del tejido. Una vez que las m…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine	Technotrade International, Inc	HPF02	With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display  of freezing parameters
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers	Technotrade International, Inc	290
Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A	Technotrade International, Inc	241-200
Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B	Technotrade International, Inc	242-200
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20	Chart
Baker's yeast			The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production
Tooth picks
Thermocouple data logger EL-USB-TC	OMEGA Engineering Inc.	OM-EL-USB-TC	Replacement battery purchased separately
Temperature probe	Electron Microscopy Sciences	34505
Heater block 12/13 mm
Rotary shaker	Fisher Scientific	11-402-10
Leaf punch – Harris Uni-core 2.00	Ted-Pella Inc.	15076
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	72660
Cryogenic vials 2 mL	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Methanol
Blow dryer
Dry ice
Liquid nitrogen
Acetone
Forceps			Several pairs