Tandem de congélation à haute pression et rapide Gel Remplacement de tissus végétaux pour microscopie électronique à transmission

Summary

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Abstract

Depuis la microscopie électronique à transmission de 1940 (TEM) a fourni des biologistes avec des images ultra-haute résolution de matériaux biologiques. Pourtant, en raison de protocoles laborieux et de longue haleine qui exigent également de l'expérience dans la préparation des échantillons sans artefact, TEM n'est pas considérée comme une technique facile à utiliser. Préparation de l'échantillon traditionnel pour la TEM fixateurs chimiques pour préserver les structures cellulaires. Congélation à haute pression est la cryofixation d'échantillons biologiques sous des pressions élevées pour produire des taux de refroidissement très rapide, limitant ainsi la formation de glace, ce qui est préjudiciable à l'intégrité de l'ultrastructure cellulaire. Congélation à haute pression et la substitution de gel sont actuellement les méthodes de choix pour la production de la morphologie de la plus haute qualité dans les sections de résine pour TEM. Ces méthodes de minimiser les artefacts normalement associés à un traitement classique pour la MET de coupes fines. Après cryofixation l'eau gelée dans l'échantillon liquide est remplacée parsolvant organique à basse température, un procédé appelé substitution de gel. Substitution gel est généralement effectuée sur plusieurs jours dans dédiée, des équipements coûteux. Une innovation récente permet que le processus soit terminé en trois heures, au lieu des deux habituelles jours. Ceci est généralement suivi par plusieurs jours de préparation de l'échantillon qui comprend l'infiltration et l'intégration dans les résines époxy avant la coupe. Nous présentons ici un protocole combinant congélation à haute pression et la substitution de congélation rapide qui permet usine échantillon fixation à accomplir en quelques heures. Le protocole peut être facilement adapté pour travailler avec d'autres tissus ou des organismes. Les tissus végétaux sont particulièrement préoccupantes en raison de la présence d'espaces aérés et vacuoles remplies d'eau qui empêchent la congélation libre de glace d'eau. En outre, le procédé de fixation chimique est d'autant plus longtemps dans les plantes en raison de parois cellulaires qui empêchent la pénétration des produits chimiques à l'intérieur des tissus profonds. Les tissus végétaux sont donc particrement difficile, mais ce protocole est fiable et fournit des échantillons de la plus haute qualité.

Introduction

Notre connaissance de l'ultrastructure cellulaire provient principalement de la microscopie électronique, qui peut résoudre les détails de l'ordre de quelques nanomètres ^1. En dépit d'être si puissant dans la résolution TEM n'est pas considéré comme convivial, comme la préparation de l'échantillon nécessite beaucoup de temps et protocoles laborieux et exige une certaine expertise du praticien. Fixation traditionnelle des échantillons a combiné l'utilisation d'aldéhydes et de tétroxyde d'osmium avant tout autre traitement qui comprend la déshydratation, l'intégration dans de la résine, puis la coupe à réaliser des coupes ultra-minces qui sont ensuite colorés par des métaux lourds. Cependant, il est connu que la fixation chimique peut produire des artefacts, y compris l'agrégation des protéines et la perte de lipides ^1, et les variations qui affectent les membranes à plusieurs compartiments cellulaires en fin de compte ^deux. Ces objets sont en grande partie attribuables à la lenteur de la fixation et de la déshydratation à la température ambiante ^{3, 4, 5.}

<p class="Jove_content"> cryofixation par congélation haute pression (HPF) évite la plupart des artefacts causés par la fixation chimique. Le principe de cryofixation est qu'il abaisse le point de congélation de l'eau de 20 degrés, ralentit la germination et la croissance des cristaux de glace et augmente la viscosité de l'eau dans un échantillon biologique, de sorte que les constituants cellulaires sont essentiellement immobilisées ^{6, 7.} HPF diminue un la température de l'échantillon à celle de l'azote liquide, sous très haute pression (210 MPa ou 2100 bars) en millisecondes. Une fois fait correctement HPF empêche la formation de gros cristaux de glace qui peuvent causer des dommages importants à l'ultrastructure cellulaire. HPF peut être utilisé pour fixer des échantillons de 100 à 200 um d'épaisseur, à des concentrations typiques de solutés biologiques ^7. Il ya de nombreux commentaires sur la physique et les principes sous-jacents HPF, par exemple, ^{1, 7, 8.}

Après HPF, les échantillons sont incubés à basse température (-78,5 ° C à -90 &N ° 176, C) en présence de solvants liquides contenant des fixateurs chimiques organiques tels que le tétroxyde d'osmium, généralement pendant quelques jours. A cette température basse, l'eau dans l'échantillon est remplacé par le solvant organique, typiquement le methanol ou l'acétone ^{1, 9.} Ainsi, ce processus est appelé substitution de gel (FS). L'échantillon est ensuite chauffé progressivement et pendant ce temps est fixé, le plus souvent avec du tétroxyde d'osmium et de l'acétate d'uranyle ^9. La reticulation à basse température présente l'avantage de fixer des molécules qui sont immobilisées ^1. FS produit donc des échantillons de qualité supérieure par rapport à celles qui sont fixées par fixation chimique classique à température ambiante, en particulier, il en résulte une meilleure préservation ultrastructurale, une meilleure conservation de l'antigénicité et de réduction de la perte de composants non liés cellulaires ^{10, 11.}

La plupart des FS est réalisée sur de longues périodes, typiquement jusqu'à plusieurs jours. Ceci est particulièrement true pour les plantes échantillons ^{12, 13, 14.} Un récent protocole développé par McDonald et Webb réduit considérablement le temps de FS de quelques jours à quelques heures ^15. Dans leur procédure rapide substitution de gel (SFT), FS est effectuée plus de 3 heures, alors que dans les FS ultra rapides (SQFS) les échantillons sont traités en 90 minutes. La qualité des échantillons produits par ces méthodes est comparable à ceux produits par des protocoles de service fixe traditionnels. Nous avons adopté le protocole de l'EFT pour le traitement en aval des échantillons de plantes après HPF. Cela s'est avéré pour sauver non seulement du temps mais aussi de l'argent, comme l'EFT et SQFS utilisent de l'équipement de laboratoire commun au lieu de les coûteuses machines disponibles dans le commerce FS.

Les tissus végétaux sont souvent très difficiles à préparer pour la MET. En moyenne, les cellules végétales sont plus grandes que soit des cellules bactériennes ou animales. La présence de la cuticule cireuse hydrophobe, des parois cellulaires épaisses, de grandes vacuoles remplies d'eau contenant des acides organiques, des hydrolases phénolique et compounds que peut occuper jusqu'à 90% du volume total de la pile ^16, et la présence d'espaces aérés diminue fortement la conductivité thermique du système ^17. En outre, dans le cas des plantes, l'épaisseur de l'échantillon dépasse presque toujours 20 pm, la limite d'utilisation de la fixation chimique. A ces épaisseurs, la faible conductivité thermique de l'eau empêche un taux de gel de plus de -10 000 ° C / sec dans le centre de l'échantillon. Ce taux est nécessaire pour éviter la formation de glace hexagonale dommageable (cristaux de glace avec une densité plus faible et plus de 10 à 15 nm) ^8. Ensemble, ces défis présents à la fois une bonne congélation de l'échantillon et FS ultérieures. Néanmoins, cryofixation est la meilleure méthode pour la fixation des échantillons de plantes. Ici, un protocole pour HPF-EFT d'échantillons de tissus de plantes sont présentées. Il est centré sur l'espèce modèle Arabidopsis thaliana, mais a aussi été utilisé avec Nicotiana benthamiana. Les résultats montrent que les caractéristiques HPF-SFT produit samples de qualité comparable à HPF-FS traditionnels dans une fraction du temps. Avec les ajustements nécessaires, ce protocole peut également être utilisé pour d'autres échantillons biologiques relativement épais.

Protocol

NOTE: La procédure de QFS nécessite beaucoup de soins et de prudence par l'utilisateur et nous mettons en évidence les consignes de sécurité ici comme précautions et remarques le cas échéant. 1.PRÉPARATION pour HPF Run Avant de commencer la préparation des échantillons, mettez au congélateur à haute pression en suivant les instructions du fabricant. REMARQUE: L'unité HPF utilisé dans ce protocole est une unité Wohlwend Compact 02 (figure 1A),…

Representative Results

Les résultats présentés ci-dessous ont été obtenus en utilisant un Compact Wohlwend 02 pour HPF (figure 1A). Un avantage majeur de cet instrument est la facilité d'utilisation des supports de spécimens et de ses détenteurs. Lors de l'utilisation d'autres instruments, McDonald recommande que deux utilisateurs doivent procéder à la préparation des échantillons et HPF, un préparation des échantillons tandis que l'autre ne le gel et le transfert de la FS Cryotubes 9….

Discussion

The success of the protocol presented here depends heavily on the user. First, advanced preparation is required to ensure that all necessary materials are readily available and in sufficient quantity to complete an entire HPF-QFS run. Second, the user must work quickly, moving from step-to-step in an efficient manner that minimizes sample handling, thus minimizing changes to the native state of the tissue. Once samples are frozen and before they are dehydrated it is imperative that they be kept cold, so care must be take…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine	Technotrade International, Inc	HPF02	With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display  of freezing parameters
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers	Technotrade International, Inc	290
Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A	Technotrade International, Inc	241-200
Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B	Technotrade International, Inc	242-200
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20	Chart
Baker's yeast			The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production
Tooth picks
Thermocouple data logger EL-USB-TC	OMEGA Engineering Inc.	OM-EL-USB-TC	Replacement battery purchased separately
Temperature probe	Electron Microscopy Sciences	34505
Heater block 12/13 mm
Rotary shaker	Fisher Scientific	11-402-10
Leaf punch – Harris Uni-core 2.00	Ted-Pella Inc.	15076
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	72660
Cryogenic vials 2 mL	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Methanol
Blow dryer
Dry ice
Liquid nitrogen
Acetone
Forceps			Several pairs