Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.
Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and γ-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.
מעבר אפיתל-mesenchymal (EMT) הוא תכנית התפתחותית שמניעה המורפוגנזה איבר ושיפוץ רקמות במהלך embryogenesis. כאשר מופעלים באופן חריג, EMT מקדם גרורות סרטני ואיבר סיסטיק 1,2. מחקרים משכנעים שתיארו את החשיבות של רגולציה תעתיק במהלך התהליך של EMT, שהוגדרו על ידי כמה גורמי שעתוק, כגון טוויסט, חילזון, וZeb, שמדחיקים את הביטוי של חלבון צומת E-cadherin adherens, וכתוצאה מכך האובדן של cobble- אבן כמו מורפולוגיה ורווח של פנוטיפ mesenchymal דמוי כישור 3-8 אפיתל. מחקרים שנעשה לאחרונה באמצעות ניתוח הגנום של RNAs חשפו כי קיים קבוצה של גני שחבור שדפוסים קשורים גם עם פנוטיפים אפיתל או mesenchymal 9,10. עבודה מהמעבדה שלנו מבחינה תפקודית מחוברת שחבור חלופי וEMT. על ידי לימוד CD44 מולקולת הידבקות פני תא, הראינו כי altern CD44שחבור יצירתי מוסדר בחוזקה במהלך EMT, ויותר מכך, שאיזופורם אחוי CD44 מיתוג סיבתי תורם לEMT 11.
שחבור חלופי מהווה מודל נפוץ ומשומר של ויסות הגנים, כעד 95% מהגנים רב אקסון אדם שחבור 12-14 לחלופין. על ידי יצירת מוצרי חלבון מרובים מגן יחיד, שחבור חלופי מהווה מנגנון חיוני לגיוון חלבון, הוספת שכבה נוספת של מורכבות לגנום האנושי. ככזה, חוסר ויסות של שחבור חלופי שעלול להוביל להשפעות ביולוגיות עמוקות גורמות למחלות בבני אדם. ואכן, שחבור חלופי חריג במחלות תועד במשך למעלה מעשור 15-25, כולל אחרונים ממצאים שמוטציות בגני מקודדי מכונות הספלייסוזום נמצאות בדרך כלל בתסמונות myelodysplastic 26-28. לכן, פיתוח שיטות אמינות לזיהוי של i שחבור החלופיsoforms הוא בעלת חשיבות רבה בחקר תהליכים ביולוגיים המגוונים כולל EMT.
כאן אנו מספקים פרוטוקול כדי לזהות שינויים בשחבור חלופי באמצעות מודל EMT מושרה. השיטות לעיצוב פריימרים PCR וגילוי isoforms אחוי הן מתאימות לא רק למחקר של שחבור חלופי במהלך EMT, אלא גם למחקר של שחבור חלופי בתהליכים ביולוגיים אחרים. חוקר שחבור חלופי במהלך EMT הוא הכרחי על מנת להבין טוב יותר את המנגנונים של EMT וגרורות סרטניים, ובכך להקל את הפיתוח של אסטרטגיות יעילות לטיפול בגרורות סרטן.
ההליך המתואר כאן מאפשר זיהוי של שחבור חלופי במודל EMT מושרה. כשינויים כאלה, דינמיים ביטוי איזופורם אחוי יכולים לנפול בפח בכל המהלך של EMT הזמן. לשיטה זו יתרונות על פני השימוש בepithelial- שונה או שורות תאים המייצגים-mesenchymal להשוואה של שחבור חלופי בגלל רקע גנטי שונה משורות תאים …
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge Wensheng Liu for invaluable help with cell imaging. This work was supported by grants from the US National Institutes of Health (R01 CA182467), American Cancer Society (RSG-09-252-01-RMC), Lynn Sage Foundation, and A Sister’s Hope Foundation.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
4-hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | Make stock solution by dissolving in ethanol to 200μM, and keep at -20℃ protected from light. |
E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit | Omega Bio-Tek | R6731 | Total RNA isolation kit |
GoScript Reverse Transcription System | Promega | A5001 | Reagent for qRT-PCR assay |
GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6002 | Reagent for qRT-PCR assay |
LightCycler 480 Real-Time PCR System | Roche | Equipment for qRT-PCR assay | |
CD44 antibody | R&D Systems | BBA10 | 1:1000 dilution |
E-cadherin antibody | Cell Signaling Technology | 4065 | 1:2500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence |
γ-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2309 | 1:1000 dilution |
occludin antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-5562 | 1:500 dilution |
fibronectin antibody | BD Transduction Laboratories | 610077 | 1:5000 dilution |
N-cadherin antibody | BD Transduction Laboratories | 610920 | 1:2000 dilution |
vimentin antibody | NeoMarkers | MS-129-p1 | 1:500 dilution |
GAPDH antibody | Millipore Corporation | MAB374 | 1:10000 dilution |
Amasham ECL Western blotting detection reagent | GE Health Life Science | RPN2209 | Chemiluminescence system |