レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで鼻生検併用して得られた嗅覚ニューロン：精神疾患における治療応答を研究するために潜在的なアプローチ
Summary
本研究では、双極性障害（BD）で治療反応のニューロン内の分子の署名を調査する新たなプラットフォームを開発し、検証した。 BD患者から嗅上皮は、鼻の生検によって得られた。その後、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、BDにおけるリチウム応答の分子署名を調査するために、リアルタイムRT PCRと組み合わせた。
Abstract
双極性障害（BD）は、あまり理解さ病態生理を伴う重度の神経精神障害であり、典型的には、気分安定剤、炭酸リチウムで処理した。動物実験ならびにヒト遺伝子研究は、リチウムがニューロンの増殖、生存および成熟に関与している分子標的に影響を与え、特にWntシグナル伝達に関与する分子ことを示している。中枢神経系（CNS）におけるリチウム応答に関連する動的な分子変化を調査するため、脳生検を得るための倫理的課題を考えると、1はこのgoal.The嗅上皮は嗅覚受容ニューロンが含まれている達成するために嗅覚組織から得られた神経細胞の使用を考慮してもよい開発およびグリア様細胞を支持する異なる段階で。これが安全に鼻の生検から得られた嗅覚組織を用い、神経精神疾患の患者のCNS中の動的な変化を研究するユニークな機会を提供します。にsubstによってもたらされる欠点を克服するために非神経細胞との生検嗅覚組織のantial汚染は、濃縮された神経細胞集団を得るための新たなアプローチは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションと鼻の生検を組み合わせることによって開発されました。本研究では、神経組織における治療関連の動的分子の変化を調査するためのシステムは、リチウム治療応答の分子機構の研究のために募集BD患者の小さなパイロットサンプルを使用し、開発し、検証した。
Introduction
双極性障害（BD）は、気分、ドライブおよび認知1における病理学的変化によって特徴付けられる深刻な神経精神障害である。 BDの治療のために使用されるリチウムは、動物試験2における多数の遺伝子の定常状態mRNAレベルを変化させることが示されているが、これらの分子のいずれかは、ヒト2における臨床応答に関連付けられている場合、それは未知のままである。リチウム応答のメカニズムを理解することは、神経組織におけるリチウム誘発性分子の変化を調査して必要になります。残念ながら、BD患者の脳生検を得るためにリチウム応答の分子シグネチャーを同定するための前および後のリチウム治療は実用的ではない。死後の脳組織はBDバイオマーカーを研究するために使用されてきたが、それらは感情、認知およびドライブの動的変化に関連する分子マーカーを評価するために使用することができない。遡及的に確認リチウム処置応答の妥当性が問題となる可能性がある4。リンパ球および他の血液細胞が有用かもしれないが、血液細胞中の分子の変化は、神経細胞の変化は3-5とは異なる場合があります。脳脊髄液は、疾患関連および投薬可逆固有の変更を反映することができる細胞内分子の情報を取得するには不十分であり得る。
嗅上皮（OE）は、大脳辺縁系の構造6に発生学的に関連した、中枢神経系（CNS）の固有の部分である。そしてそれは、鼻の生検を通じて簡単にアクセスできます。これは、で構成されていグリアのような開発7-9の異なる段階で（ すなわち、sustentacular）細胞は、基底増殖細胞、および嗅覚受容ニューロンを支援する。したがって、OEはアクセス可能に神経精神疾患7の患者のCNS 中の動的な変化を研究するユニークな機会を提供します。研究では、それらのOCCを反映疾患に関連するイベントを調査するための代用組織としてOEの有用性を実証している脳の神経細胞8,9にurring。例えば、研究は、精神状態10〜14に関連する分子のプロファイルを調査するためにOEを利用している。嗅覚系はまた、統合失調症15症の陰性症状に関連付けられている匂い赤字などの臨床endophenoytpesを識別するのに役立つ。さらに、神経発達のプロセスは、精神状態8,9の根底にある病態生理をモデル化するための有用な手段を提供し、生涯を通じてOEで続ける。
しかし、この組織の使用の欠点は、非神経細胞16と嗅覚検の実質的な汚染である。例えば、以前のOE研究において遺伝子発現研究のために使用された全RNAは、非神経細胞17からのRNAを含む全体の鼻生検組織から抽出したRNAを含有した。したがって、従来のアプローチは、細胞の品質によって制限されている。この問題を克服するために、新規なアプローチが取得するレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）で鼻生検を組み合わせることにより、神経細胞集団を富化18が開発されている。
LCMは、赤外線レーザー19-21と組み合わせるUVレーザー切断を用いて細胞を選択的に単離を可能にする技術である。 OEのアプローチでLCMを組み合わせることで、それによって神経細胞18の濃縮を強化する、非神経細胞によるOEのかなりの汚染を最小限に抑えることができます。また、ニューロンの層がそれによって染色する必要がなくなり、顕微鏡下粘膜下組織層から区別することができる。神経細胞型は、さらに関心7の細胞型により発現される一次抗体を使用して、他の細胞集団と区別することができる。したがって、この手順は、遺伝子発現研究、免疫組織化学および他の形態学的調査のために使用することができる、ほぼ純粋な神経細胞集団の濃縮のための容易にする方法を確立する。
ve_content ">この研究では、疾患状態および治療反応に関連した嗅覚ニューロンにおける分子変化を調査する実験プラットフォームを確立することを目指しています。この、に基づいて、BD用のDSM-IV診断基準を満たした禁煙の患者の小さなセットに対処するために遺伝学的研究のための診断面接（DIG）22が 2鼻の生検を受けることが募集されました：リチウム及び第二の生検で1生検前処理、毎日の経口リチウム療法の6週間後にまた、適格BD患者でなければなりません：。うつ病の症状を示す、モンゴメリー·アスベルグ評価尺度（MADRS）23投与臨床医に60の外≥10をスコアに基づいて、（YMRS）軽躁やマニアのための症候、ヤング·マニア評価尺度投与臨床医に56のうち、スコア≥10に基づく24;またはMADRSとYMRS両方で≥10両方のスケールの臨床医の間の合意の評価者·評価者間係数は> 0.96である生検の後、ニューロンは電子航法研究所だった。。LCMによってOEからCHED。組織及び神経富化から高品質のRNAの抽出を確実にするために、以下の追加の品質管理対策、リアルタイムRT PCRは、関心のある遺伝子の前および治療後の発現レベルを調べるために行った。その後のセクションでは、このアプローチの妥当性についての説明、プロトコルの最適化を強調し、トラブルシューティングのプロトコルを適用した戦略が含まれている。Protocol
Representative Results
Discussion
鼻の生検およびLCMを組み合わせることにより、濃縮された嗅覚神経細胞の層を得るための新しいプラットフォームは、提示され、この研究で確認されています。この技術は、広範な意味を持つことができる。これは、フィールド内のより広範な影響を与えて、治療応答を含めたバイオマーカーの研究、および他の神経精神状態のための薬物発見の試みに向けて適用することができる。
<p cl…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by USPHS grants MH-091460 (E.N.), MH-084018 (A.S.), MH-094268 Silvo O. Conte center (A.S.), MH-069853 (A.S.), MH-085226 (A.S.), MH-088753 (A.S.), MH-092443 (A.S.), and MH-096208 (K.I.), grants from DANA (E.N.), Stanley (A.S.), RUSK (A.S.), S-R foundations (A.S.), NARSAD (A.S. and K.I.), and Maryland Stem Cell Research Fund (A.S. and K.I.).
We sincerely appreciate the efforts and contributions of Pearl Kim, Maria Papapavlou, Nao Gamo, Youjin Chung, Yukiko Lema and Mark Christie towards coordination of the biopsy process.
Materials
| Reagent | Manufacturuer | Manufacturer Catalog # |
| Tissue Preparation | ||
| Tissue-Tek Cryomold Molds | Sakura Finetek | 4557 |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 |
| Cryosectioning | ||
| Membrane Slide 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopy | 415190-9041-000 |
| Rnase Zap | Ambion | AM9780 |
| DEPC Treated Water | Quality Biological | 351-068-131 |
| Microdissection | ||
| Microscope: PALM Series MicroLaser System | Carl Zeiss Microscopy | |
| Model: Axiovert 200M | ||
| Software: Robo v3.2 | ||
| No.5 Dumont Microdissction Forceps | Roboz | RS-49085 |
| RNA Extraction | ||
| RNAqueous Micro Kit | Ambion | AM1931 |
| cDNA Synthesis | ||
| SuperScript III First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 18080-051 |
| OMP qPCR | ||
| SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 |
| Taqman qPCR | ||
| TaqMan Expression Assay Probes | Applied Biosystems | Various |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 |
Riferimenti
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