Misure calcio citosolico nelle cellule epiteliali renali mediante citometria di flusso

Summary

Il calcio è coinvolto in numerose vie di segnalazione fisiologici e fisiopatologici. Imaging cellulare dal vivo richiede attrezzature specializzate e può richiedere molto tempo. Un rapido, metodo semplice usando un citometro di flusso per determinare variazioni relative del calcio citosolico nelle cellule epiteliali aderenti portati in sospensione è stata ottimizzata.

Abstract

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Introduction

Il calcio è un importante secondo messaggero responsabile della trasmissione dei fisiologica cellulare e segnali fisiopatologici ^1. Le concentrazioni di calcio citosolico sono tenuti bassi attraverso l'attività di pompe e scambiatori di calcio di calcio. Il / ATPasi del reticolo endoplasmatico calcio sarcoplasmatico (SERCA) riempie il reticolo endoplasmatico (ER) negozio di calcio come parte di un sistema di "perdita della pompa", mentre l'ATPasi della membrana plasmatica di calcio (PMCA) estrude calcio al compartimento extracellulare, sia in maniere ATP-dipendenti ^2. Messaggeri fisiologici, come gli ormoni o neurotrasmettitori, trasmettono i loro segnali attraverso G-recettori accoppiati alle proteine, l'attivazione della fosfolipasi C, che idrolizza fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP2) nella membrana plasmatica per generare diacilglicerolo e inositolo trifosfato (IP3) ^3. Mentre diacilglicerolo rimane nella membrana plasmatica, IP3 diffonde nel citosol e si lega al recettore IP3s (IP3Rs), che sono ligandi attivano i canali del calcio, che si trova nella membrana ER e il calcio viene rilasciato dal negozio ER luminale si conclude con un aumento delle concentrazioni di calcio citosolico ^4. Una via alternativa a calcio per raggiungere il citosol è attraverso i canali del calcio e scambiatori presenti nella membrana plasmatica. Crosstalk tra questi due comparti sono stati descritti: rilascio di calcio di calcio indotto (CICR) in cui il calcio extracellulare induce il rilascio di calcio dai depositi ER ^5, e conservare Entry operato di calcio (Soče), dove lo svuotamento dei depositi ER viene rilevata da STIM e provoca l'apertura di Orai canali del calcio nella membrana plasmatica per promuovere riempimento dei negozi ER ^6.

In condizioni fisiopatologiche, la risposta cellulare di calcio è un aumento di calcio citosolico liberalizzati e in assenza di stimolatori fisiologici ^1. La risposta di calcio può essere effettuata in vari modi: prolungata calciodel segnale, ritardato la rimozione del calcio dal citosol, esaurimento delle riserve di calcio o modifiche localizzate del calcio. Inoltre, i mitocondri assumono un ruolo centrale nel buffer e liberando calcio ^7. Prolungato e / o sovramassimale aumento di calcio citosolico porta alla morte cellulare. In realtà, il calcio è il più delle volte coinvolto nella risposta cellulare e fisiopatologico è un evento chiave in una vasta gamma di malattie, come le malattie neurodegenerative, le malattie cardiache, il cancro, le malattie delle ossa e malattie renali, che sono principalmente associato con la morte delle cellule e la perdita o l'alterazione di organo o tessuto funzione ^8-10. Inoltre, perturbazione dei segnali di calcio è stato collegato a adattamento cellulare e cambiamenti nelle funzioni e risposte cellulari.

Tradizionalmente, segnali di calcio sono misurati con un indicatore di calcio fluorescenti carica negativa che viene caricato in cellule in una cella acetossimetil permeabili (AM) forma estere. Una volta spaccati da Esteras cellularies, gli indicatori fluorescenti rimangono all'interno del compartimento intracellulare e aumentano di intensità di fluorescenza quando il calcio è legato. L'indicatore di calcio più conosciuto e utilizzato è il raziometrico Fura-2 sviluppato da Roger Tsien e colleghi ^11. Indicatori di calcio con differenti affinità per il calcio consentono diverse piscine di calcio da monitorare. Metodi di rilevamento includono l'imaging cellulare dal vivo, lettore di micropiastre a fluorescenza e citometria a flusso. La cinetica relativamente veloce dei segnali di calcio (di solito nel giro di pochi secondi a minuti) rende l'imaging cellulare dal vivo il metodo migliore per ottenere la maggior parte delle informazioni sulle caratteristiche del segnale calcio. A parte la cinetica rapida dei segnali di calcio (nel giro di millisecondi), l'imaging cellulare dal vivo è un metodo migliore per studiare compartimentalizzazione cellulare di segnalazione di calcio all'interno di una singola cella ^12. Le concentrazioni di calcio assoluti possono essere calcolate determinando la fluorescenza minima e massima della ind di calcioicator aggiungendo un chelante del calcio e permeabilizzante cellule, rispettivamente, come descritto da Grynkiewicz et al. ^11.

L'uso di citometria a flusso per misurare segnali di calcio è stato sviluppato nel 1980 in cellule immunologiche dove la possibilità di misurare più parametri, come l'integrità della membrana e la separazione della popolazione cellulare, e il requisito di cellule in sospensione in combinazione con lo sviluppo di singola lunghezza d'onda indicatori di calcio fatto citometria a flusso un metodo ideale e convenientdetection ^13-15. In cellule aderenti, cellule vive fornisce più informazioni sulla segnalazione di calcio, soprattutto la cinetica, ma richiede una configurazione complicata comprendente un microscopio a fluorescenza, un sistema di perfusione, manutenzione dell'ambiente cellulare, come la temperatura, e il software microscopio specializzato per acquisire e analisi dei dati. Metodi alternativi come ad esempio un lettore di micropiastre a fluorescenza o Pharmacolmezzi ogical attraverso l'uso di chelanti del calcio sono incomparabili in termini di informazioni acquisite. Citometria a flusso sta diventando più ampiamente usato per monitorare calcio citosolico in cellule aderenti però, nella maggior parte degli studi, solo punto finale vengono effettuate misurazioni. Utilizzando il metodo sviluppato inizialmente da Gergely et al. In cellule B immunologiche ^16, cambiamenti nella concentrazione di calcio libero citosolico di citometria a flusso con una cinetica in tempo reale e monitorare l'intensità di fluorescenza di singole cellule provenienti da un campione di popolazione sono stati misurati con successo in cellule epiteliali tumorali e cellule staminali tumorali ibridi ^17. Questo metodo è stato ulteriormente adattato per l'uso in cellule epiteliali aderenti, che sono difficili da caricare con indicatori di calcio ^18.

Qui, utilizzando una linea cellulare epiteliale aderente immortalato derivato dal segmento S1 del tubulo prossimale rene di ratto (WKPT-0293 Cl.2) ^19, descriviamo un ottimizzato m semplificatoetodo per la misurazione delle variazioni di concentrazione di calcio citosolico di citometria a flusso. Dal momento che molte cellule epiteliali in possesso di un certo numero di trasportatori organici per i composti anionici, carico di cellule con un indicatore di calcio può rivelarsi una sfida. Per impedire l'efflusso di indicatori di calcio, probenecid, l'inibitore prototipico dei trasportatori di anioni organici e originariamente sviluppato per diminuire l'escrezione renale di penicillina ^20, viene applicata simultaneamente nel mezzo di incubazione. Le cellule sono mantenute in monostrati di indicatore di calcio di carico, portati in segnali di sospensione e di calcio può essere rilevata immediatamente dopo l'aggiunta composto.

Protocol

1. Preparazione dei reagenti e soluzioni Preparare la soluzione di un sale di Hank modificato bilanciata (HBSS) (in mM: 136,9 NaCl, KCl 5,37, 0,34 Na 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 4.17 NaHCO3, pH 7,2, senza rosso fenolo). Conservare a 4 ° C. Fai 1,5 M CaCl 2 e 2 M 4- (2-idrossietil) -1 acido-piperazineethanesulfonic (HEPES) (pH 7.2) soluzione madre con acqua distillata. Preparare una soluzione 250 mM magazzino di probenecid. Per…

Representative Results

Per aumentare il calcio citosolico, due composti farmacologici sono stati applicati alle cellule renali prossimali tubulari (WKPT-0293 Cl.2) Pellicola colorante legame delle cellule di calcio permeabile, Fluo-3-AM. Campioni di controllo non trattate sono state caricate con calcio legame con colorante in presenza di probenecid e sono stati mescolati, ma senza l'aggiunta di composti. Tapsigargina (TG) è un inibitore classica della pompa SERCA che porta ad una perdita di pronto soccorso e un conseguente aumento di cal…

Discussion

Il calcio è un evento chiave in molteplici processi cellulari che agiscono come una seconda molecola di segnalazione messaggero e anche come mezzo per comunicare tra ER e mitocondri. La possibilità di misurare le variazioni delle concentrazioni di calcio citosolico libero è una tecnica utile che può applicarsi a tutti i settori della biologia cellulare. Ci sono vari metodi per rilevare segnali di calcio citosolico. Classicamente, i segnali provenienti da un indicatore di calcio raziometrica, come la Fura-2, sono mon…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fluo-3, AM	Invitrogen	F-1241	Cell permeable
Probenecid	Sigma-Aldrich	P-8761	Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Invitrogen	25300-062
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
Thapsigargin	Tocris Bioscience	1138
Tunicamycin	Sigma-Aldrich	T7765
FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software	Becton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)	Joe Trotter, The Scripps Institute		Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.
WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line			Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH)