The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.
Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.
Den modne ventilen er sammensatt av tre stratifiserte lag av spesialiserte ekstracellulære matriks (ECM) ispedd ventil interstitielle celler (vics) og innkapslet av et enkelt lag av hjerteklaff endotelceller (VECs) 1. Rollen til ECM er å gi alle nødvendige biomekaniske egenskaper til å tåle stadige endringer i hemodynamisk kraft i løpet av hjertesyklusen. Omsetning av ventil ECM i voksen ventilen er strengt regulert av vics som er stort sett stillestående, og fibroblast-lignende i fravær av sykdommen. I tillegg til den VIC populasjon, hjerteklaff endotelceller (VECs) danner en uavbrutt endotel over overflaten av ventilspissene 2. Mens betydningen av ECM og Vics for ventil struktur og funksjon er beskrevet av oss og andre, er rollen VECs mindre kjent. Dette er imidlertid forholdsvis liten cellepopulasjon kritisk for ventildannelse i fosteret, og er beskrevet som dysfunksjonell i ventilsykdom.
Hjerteklaff formasjonen i embryoet begynner når en undergruppe av endotelceller innenfor atrioventrikulær kanalen og utstrømning veis regioner gjennomgå endothelial til mesenchymale transformasjon (EMT) og danner hevelser kjent som endokardiale puter 1,3. De nylig forvandlet mesenchymalceller innenfor disse strukturene senere differensiere i Vics og danner de modne ventiler. Når EMT er fullført, endotelceller liggende puter, betegnet VECs, danner en uavbrutt endotelcelle lag som beskytter det modne ventilen mot skade. I tillegg VECs avføle hemodynamiske miljø og har vist seg å molekylært kommunisere med underliggende vics å regulere ECM homeostase 1,3. I syke ventiler, er VEC monolayer forstyrret i forbindelse med unormale endringer i ECM organisasjon og endrede biomekanikk 4,5. I tillegg studier i musemodeller tyder på at VEC dysfunksjon er den underliggende årsaken til ventil disease 1,6-9. Som VECs spille en viktig rolle i ventil utvikling, vedlikehold og sykdom, er det viktig at vi fullt definere sine timelige fenotyper for å fremme feltet og forstå mekanismene for sykdom.
Tidligere arbeid ved flere laboratorier har lyktes i å isolere VECs fra svin og sau modeller 10-12. På grunn av den store størrelsen til disse ventiler, isoleringer gjennom swabbing og / eller enzymatisk behandling, etterfulgt av en rekke forskjellige metoder, inkludert isolasjon på magnetiske kuler celleseparasjon og enkelt celle klonal ekspansjon har vært effektiv for å generere rene populasjoner 11-13. Imidlertid kan disse modellene være begrensende på grunn av den ufullstendige annotering av gris og sau genomer som begrenser tilgjengeligheten av molekylære verktøy i tillegg til de høye kostnader. Derfor eksperimentering av svin og sau VECs etter isolasjon kan være restriktiv. Musemodeller er å foretrekke på grunn av de mange mulighetene for genetisk manipulasjon og molekylære verktøy i embryo og voksen, men til dags dato, ingen VEC isoleringer i små dyremodeller har blitt rapportert. Dette er sannsynligvis på grunn av vanskelighetene med å jobbe med små vevsprøver som inkluderer et mindretall cellepopulasjon som i dag mangler unik identitet VEC-spesifikke markører, og dermed hindre antistoffbasert isolasjonsmetoder.
I denne artikkelen rapporterer vi en ny metode for direkte isolasjon av murine VECs på embryonale og voksne stadier. Denne protokollen tar seg av Tie2-GFP mus som uttrykker GFP i alle endothelial celletyper og har vært mye brukt for å studere endothelial cellepopulasjoner 14. Imidlertid er det nye ved denne studien at disse musene, for første gang er blitt anvendt for å isolere endotelceller fra ventilene. Ved forsiktig dissekering av ventil vev og en serie på ni enzymatiske fordøyelse etterfulgt av FACS sortering kan VECs isoleres og brukes til forskjellige eksperimentelle teknikkercluding RNA ekstraksjon og kultur, direkte etter sortering.
Her beskriver vi for første gang, en ny fremgangsmåte for isolering av embryoniske og voksen murine VECs fra Tie2-GFP mus. Mens denne musen linje har vært mye brukt til isolering av endoteliale cellepopulasjoner, er dette den første rapporten som viser selektiv isolering av VECs. På grunn av sårbarheten i VEC befolkningen, har vi utviklet en streng protokoll som gjør det mulig for enkelt celle isolering av GFP positive (og GFP negative) celler fra hjerteklaffer av embryonale og voksne mus. Sammenlignet med den originale publikasjon ved hjelp av hele embryoer eller organer fra Tie2-GFP mus 14, har vi optimalisert kollagenase og disseksjon måten basert på den lave overflod av denne skjøre endotelial cellepopulasjon for å isolere en utvalgt populasjon av celler.
VEC isoleringer har tidligere kun blitt rapportert i store dyremodeller med begrensede genetiske og biomolekylære verktøy. Disse verktøyene er vel etablert i mus og derfor abiheten for å isolere murine VECs tillater et utvidet sett av eksperimentelle design som skal brukes for en hjerteklaff forskning. Derfor, er en betydelig fordel med denne tilnærming som VECs kan isoleres temporært fra villtype mus, og modeller av ventil sykdom og skade. En annen fordel er at VECs kan bli isolert og analysert nesten umiddelbart etter disseksjon, bevare uttrykk mønstre som reflekterer in vivo-situasjonen mer nøyaktig. Videre er denne isolasjonsprotokoll er tilstrekkelig til å fjerne cellekultur for nummer ekspansjon og derfor potensielle fenotypiske endringer indusert ved in vitro miljøet blir forhindret.
Til tross for nyheter og eksperimentelle fordelene ved denne protokollen, innser vi at begrensningene fortsatt eksisterer. Først, er størrelsen på VEC populasjonen i løpet av murine ventiler meget liten og derfor vil flere tidsbestemte embryonale kullene er nødvendig for å generere tilstrekkelig RNA genekspresjon analyse for. Mens this kan overvinnes ved hjelp av flere oppdrettere, kan det ha en innvirkning på anvendelsen av noen post-isolasjon analyseverktøy. Denne begrensningen har vært en utfordring spesielt for å etablere konfluente kulturer av GFP-positive VECs for å utføre flere grundige analyser av VEC fenotyper inkludert molekylære profiler og funksjonelle analyser. Derfor erkjenner vi at ikke alle problemer har blitt overvunnet ved vår tilnærming, men dette er et område av interesse at vi strever etter å overvinne.
Denne tilnærmingen isolere VECs fra valvulære regioner introduserer muligheten for forurensning fra Tie-GFP -positive, ikke-klaffe endotelceller endocardium, eller vaskulære strukturer i ventrikkel myokard. Hittil har molekylær æren av VECs fra andre kardiale endoteliale cellepopulasjoner ikke blitt identifisert. Men en enhancer region av Nfatc1 genet har blitt identifisert og vist å spesifikt merke VECs som ikke gjørgjennomgå EMT, og ingen andre endotelial cellepopulasjon i hjertet 18. Som en Cre-modellen (Nfatc1 Encre) er tilgjengelig, kan fremtidige studier utnytte det spesielle ved denne linjen for å redusere forurensning risiko. I tillegg til ikke-valvulær Tie2-GFP- positive celler, er det alltid mulighet for forurensning fra myocytter ved det punkt hvor klaffbladene festes til det ringformede område av den septale og mural myokardielle vegger. I data som ikke vises her, vi først begynte studier for å isolere VECs fra dissekert valvulære regioner ved hjelp av antistoff-konjugert perler belagt med anti-GFP og anti-CD31. Mens denne tilnærmingen var vellykket for å isolere endotelceller, opplevde vi betydelig celle klumper fra tilstøtende og ikke-endothelial celletyper og derfor Vics og hjartecellene forurenset vår eksperimentelle prøven. Dette har vært unngått ved bruk av FACS analyse som parametre har blitt satt til å isolere bare enkelt celle suspensjons, og PCR-analyse for å detektere ekspresjon av myocyte-spesifikke gener har kontrollert for denne begrensningen (figur 3). Mens vår forurensning kan bli ansett som minimal, er det fortsatt et potensial eksperimentelle kompleksitet som kan unngås i fremtiden med den dobbelte utvalg av GFP og endotelcelle-spesifikt overflatemarkører.
Ved hjelp av denne protokollen, har vi lykkes isolerte VECs fra embryonale og voksne mus og førsteklasses eksempler på hvordan denne tilnærmingen kan brukes for RNA isolering og cellekultur av GFP positive og GFP negative cellepopulasjoner. Imidlertid er denne metoden ikke er begrenset til disse anvendelser og kan benyttes for en mengde molekylære, funksjonelle og cellulære tilnærminger. I tillegg kan Tie2-GFP bakgrunn bli avlet med genetiske musemodeller som vil tillate for komparative studier av VEC populasjoner i helse og sykdom. Utviklingen av denne romanen metodikk vil, for første gang, gi rom for fokuserte studierundersøke bidraget fra VECs i ventil utvikling og vedlikehold, og kunne avsløre tidligere unappreciated mekanismer endothelial avhengig ventil sykdom.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker The Ohio State University Comprehensive Cancer Center Analytical cytometri Kjerne anlegget, spesielt Katrina Moore, for teknisk assistanse med FACS analyse. I tillegg ser vi Dr. William Pu og hans gruppe for sine vitenskapelige innsikter. Dette arbeidet ble støttet av NIH HL091878 (JL) og The Heart Center på Nationwide Children Hospital.
[header] | |||
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life Technologies | A-11077 | |
70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
2.5% Trypsin | Invitrogen LT | 15090-046 | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
CD31 rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553370 | |
Chick Serum | Invitrogen LT | 16110-082 | |
Collagenase IV | Invitrogen LT | 17104-019 | Prepared according to manufactuer's instructions |
DNase I, RNase free (10,000 Units) | Roche | 4716728001 | |
EBM-2 | Lonza | CC3156 | For VEC media |
EDTA, 0.5M Solution | Hoefer | 03-500-506 | |
EGM2 SingleQuot, Bulletkit | Lonza | CC-4176 | For VEC media |
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Hyclone | SH3007103IH | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
Horse Serum | Invitrogen LT | 16050-130 | |
Hybridization Oven | VWR | 230301V | |
Medium 199 1X | Corning Cell gro | 10-060-CV | |
Paraformaldehyde 16% Solution EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Pen/Strep | MP-Biomed | ICN1670049 | |
Permanox sterile chamber slide with cover | Thermo-Scientific | 177429 | |
Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning Cell gro | 21-040-CV | |
PrimeTime Mini qPCR Assay | Integrated DNA Technologies | Acta2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
SuperScript VILO Mastermix | Invitrogen LT | 11755050 | |
Tie2-GFP mice | Jackson Laboratories | 3658 | |
Tissue forceps #5 11cm | Dumont | 14096 | |
Trizol | Ambion | 15596018 | |
α-SMA anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A2547 | |
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |