The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.
Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.
Den modne ventil er sammensat af tre lagdelte lag af specialiserede ekstracellulære matrix (ECM) afbrudt med ventil interstitielle celler (vics) og indkapslet af et enkelt lag af hjerteklap endotelceller (VECs) 1. Rolle ECM er at tilvejebringe alle de nødvendige biomekaniske egenskaber til at modstå konstante ændringer i hæmodynamiske kraft i hjertets cyklus. Omsætningen af ventilen ECM i den voksne ventilen er stramt reguleret af Vics, der stort set hvilende og fibroblast-lignende i fravær af sygdom. Ud over VIC befolkning, hjerteklap endotelceller (VECs) udgør en uafbrudt endotel over overfladen af ventil spidserne 2. Mens betydningen af ECM og Vics til ventil struktur og funktion er blevet beskrevet af os og andre, er den rolle, VECs mindre kendt. Men dette forholdsvis lille cellepopulation er kritisk for ventil dannelse i embryoet og beskrives som dysfunktionel ventilsygdom.
Hjerteklap dannelse i fosteret begynder, når en delmængde af endotelceller inden for de atrioventrikulære kanalen og udstrømning tarmkanalen regioner gennemgå endotel til mesenkymale omdannelse (EMT) og danner hævelser kendt som endokardiale puder 1,3. De nyligt transformerede mesenchymal-celler i disse strukturer senere differentiere til vics og danne modne ventiler. Når EMT er færdig, endotelceller omgiver puder, betegnet VECs danner en uafbrudt endotelcelle lag, der beskytter det modne ventil mod skade. Desuden fornemmer VECs hæmodynamiske miljø og har vist sig at molekylært kommunikere med underliggende vics at regulere ECM homeostase 1,3. I syge ventiler er VEC monolag forstyrret i forbindelse med unormale ændringer i ECM organisation og ændret biomekanik 4,5. Hertil kommer, at studier i musemodeller tyder på, at VEC dysfunktion er den underliggende årsag til ventil disease 1,6-9. Som VECs spiller en vigtig rolle i ventil udvikling, vedligeholdelse og sygdom, er det vigtigt, at vi definerer deres timelige fænotyper fuldt ud for at fremme feltet og forstå mekanismerne i sygdommen.
Tidligere arbejde af flere laboratorier har med held isoleret VECs fra svin og får modeller 10-12. På grund af den store størrelse af disse ventiler, isolationer gennem podning og / eller enzymatisk spaltning efterfulgt af en række forskellige isoleringsmetoder herunder magnetisk perle celleseparation og enkelt celle klonal ekspansion har været effektiv til at frembringe rene populationer 11-13. Dog kan disse modeller være begrænsende på grund af ufuldstændige Angivelse af svin og får genomer begrænser tilgængeligheden af molekylære værktøjer i tillæg til de høje omkostninger. Derfor forsøg med svin og får VECs efter isolering kan være restriktiv. Musemodeller er at foretrække på grund af de mange muligheder for genetisk manipulation og molekylære værktøjer i embryo og voksne, men til dato er der ingen VEC isolationer i små dyremodeller er blevet rapporteret. Dette er sandsynligvis på grund af vanskeligheden ved at arbejde med små vævsprøver, der omfatter et mindretal cellepopulation, der på nuværende tidspunkt mangler unikke identitet VEC-specifikke markører, for derved at forhindre antistofbaserede isoleringsmetoder.
I denne artikel rapporterer vi en ny metode til direkte isolering af murine VECs på embryonale og voksne stadier. Denne protokol udnytter Tie2-GFP-mus, der udtrykker GFP i alle endotelceller celletyper og er blevet grundigt anvendes til at studere endotel cellepopulationer 14. Nyhed af denne aktuelle undersøgelse er imidlertid, at disse mus, for første gang er blevet anvendt til at isolere endothelceller fra ventilerne. Ved omhyggelig dissektion af ventilen væv og en serie på ni enzymatiske spaltninger efterfulgt af FACS-sortering kan VECs isoleres og anvendes til forskellige eksperimentelle teknikker icluding RNA-ekstraktion og kultur, direkte efter sortering.
Her beskriver vi for første gang, en hidtil ukendt fremgangsmåde til isolering af embryoniske og voksne murine VECs fra Tie2-GFP-mus. Mens denne mus linje er blevet udstrakt anvendt til isolering af endothelceller cellepopulationer, dette er den første rapport, der viser selektiv isolering af VECs. På grund af den skrøbelige VEC befolkning, har vi udviklet et stringent protokol, der giver mulighed for enkelt celle isolering af GFP-positive (og GFP negativ) celler fra hjerteklapper af embryonale og voksne mus. Sammenlignet med den originale publikation anvendelse af hele embryoer eller organer fra Tie2-GFP-mus 14, har vi optimeret collagenase og dissektion trin baseres på den lave forekomst af denne skrøbelige endotelcelle befolkning at isolere en udvalgt population af celler.
VEC isoleringer er tidligere kun blevet rapporteret i store dyremodeller med begrænsede genetiske og biomolekylære værktøj. Disse værktøjer er veletableret i mus, og derfor ABIheden at isolere murine VECs giver mulighed for en udvidet sæt af eksperimentelle design, der skal anvendes til hjerteklap forskning. Derfor er en væsentlig fordel ved denne fremgangsmåde er, at VECs kan isoleres tidsmæssigt fra vildtypemus, og modeller af ventil sygdom og skade. En anden fordel er, at VECs kan isoleres og analyseres næsten umiddelbart efter dissektion, bevare ekspressionsmønstre, der afspejler in vivo-situationen mere nøjagtigt. Endvidere denne isolation protokol er tilstrækkelig til at fjerne cellekultur efter nummer ekspansion og derfor potentielle fænotypiske ændringer induceret af in vitro miljøet forhindres.
På trods af de nyheder og eksperimentelle fordele ved denne protokol, anerkender vi, at begrænsninger stadig eksisterer. Først størrelse VEC befolkning i murine ventiler er meget lille, og derfor er der behov for flere timede embryonale kuld for at generere tilstrækkelig RNA til genekspression analyse. Mens thir kan overvindes ved hjælp af flere opdrættere, kan det have indflydelse på anvendelsen af nogle post-isolation analyseværktøjer. Denne begrænsning har været en udfordring især for oprettelse sammenflydende kulturer af GFP-positive VECs for at udføre flere grundige analyser af VEC fænotyper herunder molekylære profiler og funktionelle assays. Anerkender derfor, vi, at ikke alle problemer er blevet overvundet af vores tilgang, men dette er et område af interesse, at vi stræber efter at overvinde.
Denne tilgang isolere VECs fra skallerne regioner indfører muligheden for forurening fra Tie-GFP-positive, ikke-valvulær endotelceller endocardium eller vaskulære strukturer i den ventrikulære myocardium. Til dato har molekylære skelnen af VECs fra andre kardiale endotelcellespecifikke populationer ikke blevet identificeret. Imidlertid en enhancer region af Nfatc1 genet er blevet identificeret og har vist at specifikt mærke VECs der ikkeunderkastes EMT, og ingen andre endotelcelle befolkning i hjertet 18. Som en CRE model (Nfatc1 Encre) er tilgængelig, kan fremtidige undersøgelser udnytte specificiteten af denne linje for at minimere risikoen for forurening. Ud over nonvalvulær Tie2-GFP- positive celler, er der altid muligheden for forurening fra myocytter ved det punkt, hvor ventilblade Sammen med det ringformede område af septal og vægmaleri myokardie vægge. I data, der ikke er vist her, vi begyndte oprindeligt undersøgelser for at isolere VECs fra dissekerede valvulær områder med antistof-konjugerede perler overtrukket med anti-GFP-og anti-CD31. Mens denne tilgang var en succes til isolering endothelcellerne, oplevede vi en betydelig celle sammenklumpning fra tilstødende, ikke-endotel celletyper og dermed Vics og myokardieceller forurenet vores eksperimentelle prøve. Dette er undgået ved hjælp af FACS-analyse som parametre er blevet indstillet til at isolere kun enkelt cellesuspensions og PCR-analyse til påvisning af ekspression af myocyt-specifikke gener er kontrolleret for denne begrænsning (figur 3). Mens vores forurening kan anses som minimal, er det stadig en potentiel eksperimentel kompleksitet, som kunne undgås i fremtiden med den dobbelte udvælgelse af GFP og endotelcellespecifikke overflademarkører.
Ved hjælp af denne protokol, har vi med succes isolerede VECs fra embryonale og voksne mus og gav eksempler på, hvordan denne metode kan anvendes til RNA-isolering og cellekultur af GFP-positive og GFP negativ cellepopulationer. Imidlertid er denne fremgangsmåde ikke er begrænset til disse anvendelser, og kan anvendes til en overflod af molekylære, cellulære og funktionelle metoder. Derudover kan Tie2-GFP baggrund blive avlet med genetiske musemodeller, der vil give mulighed for sammenlignende studier af VEC befolkninger i sundhed og sygdom. Udviklingen af denne nye metode vil for første gang mulighed for fokuserede undersøgelserundersøge bidrag VECs ventil udvikling og vedligeholdelse og kan afsløre hidtil miskendte mekanismer endotel-afhængig ventil sygdom.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Ohio State University Omfattende Cancer Center Analytisk cytometri Core facilitet, specielt Katrina Moore, til teknisk bistand med FACS-analyse. Derudover anerkender vi Dr. William Pu og hans gruppe for deres videnskabelige indsigter. Dette arbejde blev støttet af NIH HL091878 (JL) og hjertecentret på Nationwide Børnehospital.
[header] | |||
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life Technologies | A-11077 | |
70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
2.5% Trypsin | Invitrogen LT | 15090-046 | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
CD31 rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553370 | |
Chick Serum | Invitrogen LT | 16110-082 | |
Collagenase IV | Invitrogen LT | 17104-019 | Prepared according to manufactuer's instructions |
DNase I, RNase free (10,000 Units) | Roche | 4716728001 | |
EBM-2 | Lonza | CC3156 | For VEC media |
EDTA, 0.5M Solution | Hoefer | 03-500-506 | |
EGM2 SingleQuot, Bulletkit | Lonza | CC-4176 | For VEC media |
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Hyclone | SH3007103IH | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
Horse Serum | Invitrogen LT | 16050-130 | |
Hybridization Oven | VWR | 230301V | |
Medium 199 1X | Corning Cell gro | 10-060-CV | |
Paraformaldehyde 16% Solution EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Pen/Strep | MP-Biomed | ICN1670049 | |
Permanox sterile chamber slide with cover | Thermo-Scientific | 177429 | |
Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning Cell gro | 21-040-CV | |
PrimeTime Mini qPCR Assay | Integrated DNA Technologies | Acta2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
SuperScript VILO Mastermix | Invitrogen LT | 11755050 | |
Tie2-GFP mice | Jackson Laboratories | 3658 | |
Tissue forceps #5 11cm | Dumont | 14096 | |
Trizol | Ambion | 15596018 | |
α-SMA anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A2547 | |
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |