Actividad telomerasa en las diversas regiones del cerebro de ratón: La telomerasa no radiactivo Repetir Protocolo de Amplificación (TRAP) Ensayo
Summary
Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.
Abstract
La telomerasa, una ribonucleoproteína, es responsable de mantener la longitud de los telómeros y por lo tanto la promoción de la integridad genómica, la proliferación, y la vida útil. Además, la telomerasa protege la mitocondria de estrés oxidativo y confiere resistencia a la apoptosis, lo que sugiere su posible importancia para el sobreviviente de la no-mitótico, las células altamente activos, tales como neuronas. Hemos demostrado previamente la capacidad de los nuevos activadores de telomerasa para aumentar la actividad y la expresión de la telomerasa en las diversas regiones de cerebro de ratón y para proteger a las células neuronas motoras del estrés oxidativo. Estos resultados refuerzan la noción de que la telomerasa está implicado en la protección de las neuronas de diversas lesiones. Para subrayar el papel de la telomerasa en el cerebro, que aquí comparamos la actividad de la telomerasa en el cerebro de ratones macho y hembra y su dependencia de la edad. Ensayo TRAP es un método estándar para la detección de actividad de la telomerasa en varios tejidos o líneas celulares. Aquí se demuestra el anásis de la actividad de la telomerasa en tres regiones del cerebro de ratón por no desnaturalizante de extracción de proteínas utilizando CHAPS tampón de lisis seguido por modificación del ensayo TRAP estándar.
En este ensayo de 2 pasos, la telomerasa endógena se alarga un sustrato específico de la telomerasa (cebador TS) mediante la adición de 6 repeticiones TTAGGG pb (reacción de la telomerasa). Los productos de reacción de telomerasa se amplifican por reacción PCR crear una escalera de ADN de incrementos de 6 pb. El análisis de la escalera de ADN se realizó por electroforesis en gel de agarosa de alta resolución 4,5% seguido de tinción con colorante de ácidos nucleicos altamente sensibles.
En comparación con el ensayo TRAP tradicional que utilizan marcado con 32P radiactivo dCTP de para la detección de ADN y la electroforesis en gel de poliacrilamida para la resolución de la escalera del ADN, este protocolo ofrece un ahorro de ensayo TRAP para evaluar la actividad de la telomerasa en el cerebro del ratón, lo que demuestra la capacidad de tiempo no tóxica detectar diferencias en telomerasactividad de correo en los distintos región del cerebro del ratón hembra y macho.
Introduction
La telomerasa es una ribonucleoproteína compuesta de la telomerasa transcriptasa inversa (terc), la subunidad catalítica de la telomerasa, y un componente de ARN (TERC). El papel canónica de la telomerasa es preservar la longitud adecuada de los telómeros mediante la adición de secuencias repetitivas (TTAGGG) a los extremos teloméricas, por lo tanto, la promoción de la integridad genómica, y la proliferación celular 1. Funciones adicionales se atribuyeron a de TERT en células, es decir, que confiere resistencia a la inducida por diversos agente que daña el 2 apoptosis, protege a las células madre mesenquimatosas humanas del estrés oxidativo 3, y desempeña un papel pro-supervivencia en neuronas completamente diferenciadas por su asociación a TIA1 ARN positivo gránulos 4.
De TERT se expresa y se activa principalmente en las células somáticas de dividirse y en la mayoría de tipos de cáncer, mientras que los niveles de expresión y actividad de la enzima están estrechamente regulado en las células que no se dividen 5,6. Los estudios han demostrado que en el rOdent cerebro, actividad de la telomerasa se convierte en indetectable por día postnatal 10, mientras que el ARNm de TERT se mantiene a niveles más bajos en la edad adulta 7. Otros estudios demostraron actividad de la telomerasa en la zona sub-ventricular adulto, el bulbo olfatorio, el hipocampo, y en el cerebelo y la corteza adultos 8. Recientemente hemos demostrado que nuevos compuestos que aumentan la expresión y la actividad de la telomerasa en las cuerdas cerebro y la médula ejercen efectos neuroprotectores en N-metil-D-aspartato (NMDA) – ratones inyectados, retrasaron el inicio y la progresión de la enfermedad esclerosis lateral amiotrófica en transgénicos SOD1 ratones y aumentó la supervivencia de las neuronas motoras en la médula espinal de estos ratones 9. Para entender completamente la función pro-supervivencia de la telomerasa en las neuronas y en el cerebro, es esencial para desarrollar un ensayo rápido simple y relativamente sensible para la detección de la actividad de la telomerasa en las diversas regiones del cerebro.
El telomérica rprotocolo de amplificación EPEAT (TRAP) es un ensayo sensible conocida la combinación de la actividad de la telomerasa y canónica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En este ensayo, la telomerasa añade TTAGGG repite a un sustrato de telomerasa (TS imprimación) oligonucleótido, seguido de la amplificación por PCR que genera 6 pares de bases (pb) escalera de ADN utilizando el TS cebador inverso -. ACX marcado con 32P dCTP de se utilizan para detectar la baja cantidad de productos de PCR. La escalera de ADN se resolvió por electroforesis en gel de poliacrilamida de secuenciación (PAGE). Tanto la intensidad de las bandas de ADN y la longitud de la escalera de ADN reflejan la cantidad de moléculas de enzimas activas y su procesividad respectivamente 10.
Este ensayo tradicional tiene algunas dificultades importantes: El peligro de la exposición a sustancias radiactivas, grandes y difíciles de manejar PÁGINA secuenciación y el consumo de tiempo de la carrera en gel y exposición de la película del producto radiactivo (durante la noche en ambos casos). </p>
Este protocolo ofrece un ensayo de agarosa no radiactivo mejora mini-gel a base. La escalera del ADN 6 pb se resuelve usando gel de agarosa de alta resolución de 4,5% y la detección se logra utilizando colorante de ácidos nucleicos altamente sensibles. La combinación de alta resolución de agarosa usando mini-gel y tinción de ácido nucleico sensible ofrece fácil de manejar ensayo, elimina los peligros de la exposición a la radiactividad y se reducirá considerablemente la duración total del ensayo de 3 días a varias horas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Análisis de la actividad de la telomerasa en el cerebro del ratón a través de la trampa de ensayo consiste en 4 pasos principales: 1) proteínas de extracción a partir de regiones específicas del tejido cerebral 2) TS de elongación de iniciador de telomerasa por – reacción de la telomerasa 3) amplificación de los productos de reacción de telomerasa mediante PCR 4 ) separación de los productos de PCR usando gel de agarosa de alta resolución.
Este ensayo TRAP modificado aborda dos g…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially supported by B.G. Negev technology and Linda Powers’s contribution.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| TRAP Mix (X10) | Made manually, mix the following in UPW: 630mM KCl, 200mM Tris-HCl pH8.2, 10mM EDTA, 15mM MgCl2, 1mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from sigma). Aliquots are freezed in -20 C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124mM NaCl, 3mM KCl, 1.25mM NaH2PO4*H2O, 2mM MgSO4, 26mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTP's 10 mM | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic-acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
Riferimenti
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- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
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- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
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