This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.
Under spermatogenese hos pattedyr og i Drosophila melanogaster, mannlige kjønnsceller utvikle seg i en rekke viktige utviklingsprosesser. Dette omfatter differensiering fra en stamme cellepopulasjon, mitotisk forsterkning, og meiose. I tillegg, etter meiotisk kimceller gjennomgå en dramatisk morfologisk omforming prosessen så vel som en global epigenetisk rekonfigurering av bakterie linjen kromatin-den histon-til-protamin-bryteren.
Studerer rollen av et protein i post-meiotisk spermatoge hjelp mutagenese eller andre genetiske verktøy er ofte hemmes av avgjørende embryonale, pre-meiotisk, eller meiotisk funksjonene til protein under etterforskning. Den post-meiotisk fenotype av en mutant av et slikt protein kan være skjult gjennom et tidligere utviklings blokk, eller tolkningen av fenotype kan være komplisert. Modellen organisme Drosophila melanogaster tilbyr en bypass på dette problemet: intakte testikler ogselv cyster av kimceller dissekert fra tidlig puppe er i stand til å utvikle ex vivo i dyrkningsmedium. Å gjøre bruk av slike kulturer tillater mikroskopisk avbildning av levende kjønnsceller i testiklene og bakterie linjer cyster. Viktigere, de dyrket testikler og kjønnsceller også blitt tilgjengelig for farmakologiske hemmere, dermed tillater manipulering av enzymatiske funksjoner under spermatogenesen, inkludert post-meiotisk etapper.
Protokollen presenteres beskriver hvordan å dissekere og dyrke pupal testikler og bakterie linjer cyster. Informasjon om utviklingen av pupal testikler og kultur forhold er gitt sammen med mikroskop bildedata av levende testikler og bakterie linjer cyster i kultur. Vi beskriver også en farmakologisk test for å studere post-meiotisk spermatogenese, eksemplifisert ved et assay rettet mot histon-til-protamin-bryteren ved hjelp av histon-acetyltransferase inhibitor anacardic syre. I prinsippet kan denne dyrkningsmetode tilpasses for å møte mange other problemstillinger i pre-og post-meiotisk spermatogenesen.
Utviklingen av hannkjønnscellene til mange arter er en sekvensiell prosess. Det er preget av en rekke viktige hendelser som kulminerer i dannelsen av morfologisk og epigenetically høyt spesialisert sædceller. I Drosophila melanogaster, bakterie-line stamceller på tuppen av testis skillet asymmetrisk å gi opphav til en ny stamcelle og spermatogonium, dvs. dattercelle som er forpliktet til differensiering (se figur 1 for en oversikt) 1,2 . Den spermatogonium gjennomgår fire runder med mitotiske divisjoner, og med utbruddet av meiose, en fase med imponerende vekst og transcriptional aktivitet kalt spermatocyte scenen. De celler som stammer fra en spermatogonium forblir koblet til hverandre og utvikle seg som et synkronisert innpakket bunt av to somatiske celler-en struktur som det refereres til som en cyste. Etter fullførelse av meiose, er morfologien av de mannlige kjønnsceller heltomorganisert (skjematisk vist i figur 1). Til å begynne med runde spermatider langstrakt for å danne hydrodynamisk hode struktur, og flagell utvikler seg. Til slutt blir sædcellene skilt fra hverandre ved hjelp av en kompleks, apoptose-relaterte mekanisme kalt individualisering 3-5.
I mange arter, inkludert Drosophila melanogaster og pattedyrarter, de morfologiske endringer av kjønnsceller er ledsaget av en bemerkelsesverdig epigenetisk omorganisering av haploid mannlige bakterie-line kromatin, kalt histoner-til-protamin bryteren (HP switch) 6 – 9. Muligens nesten alle kanonisk histon og mange histon-variantmolekyler er strippet fra DNA og erstattes av små grunnleggende proteiner, de protamines, noe som resulterer i meget kompakt nucleoprotamine struktur bestemt til kromatin av modne sædceller. Generell beskrivelse av HP-bryteren er than utskifting av kanoniske histoner første av histon varianter, så av overgangs proteiner, og til slutt av protamines. Alt dette er ledsaget av flere endringer i epigenetiske merker, som for eksempel en økning i acetylering nivåer av histon H4 like før histoner fjerning 7,10 – 12.
De fleste, om ikke alle, av de ovennevnte prosesser er essensielt for utviklingen av modne, fullt frukt sperm. Dette gjelder ikke bare i Drosophila, men også hos mennesker, som pattedyrspermatogenesen deler en betydelig mengde av likheten med systemet invertebrate 1,8,9. Studerer mannlig bakterie-celle utvikling er mye lettere i Drosophila modellsystemet. Fluer er genetisk svært tilgjengelig. Generering av mutanter, samt etablering av flue stammer uttrykker fusion gener eller RNA-interferens konstruerer tar litt innsats. Imidlertid, i studiet av post-meiotisk spermatogenese, bruk av en mutanterd enkle genetiske verktøy kunne nå en grense. I Drosophila spermatogenesen, opphører transkripsjon nesten helt med inngåelse meiotisk divisjoner. Således er post-meiotisk spermatogenese i hovedsak basert på translasjonelt trykt og lagret mRNA syntetisert i en utvidet meiotisk prophase 13-16. Derfor verktøy som RNA-interferens eller bruk av ikke-betingede mutanter er ikke egnet for å studere spesielt de post-meiotisk roller genprodukter som også oppfyller viktige funksjoner i pre-meiotisk eller meiotisk bakterie celle utvikling.
En fordel med Drosophila som kan utnyttes i slike tilfeller er evnen dissekert intakte testikler og selv cyster av kjønnsceller for å utvikle ex vivo i dyrkningsmedium 4,12,17 – 20. Disseksjon og dyrking av testikler eller bakterie linjer cyster ikke bare tillater mikroskopisk observasjon av bakterie-celle utvikling i levende celler, men enLSO bruk av farmakologiske analyser med, for eksempel, hemmere av enzymet komplekser som histon acetyltransferases (hatt), histon deacetylases (HDACs), topoisomerases, eller proteasom. Således er det mulig å manipulere enzymatiske funksjoner under post-meiotisk spermatogenese, og for å overvåke den utviklingsmessige resultater uavhengig av embryonale, pre-meiotisk eller meiotisk funksjoner 4,12.
I farmakologiske analyser, vi tidligere analyserte acetylering avhengige lokalisering av en bromodomain protein under meiotisk prophase samt relevansen av histon acetylering nivåer for epigenetisk HP bryteren i post-meiotisk spermatogenese ved å bruke spesifikke hemmere rettet hatter og HDACs 12,21. Targeting HP bryteren i disse analysene ble gjort mulig ved hjelp av en flue belastning som uttrykker fusion gener histone2AvD-RFP og protamineB-EGFP 12,22 i de endogene mønstre, og den observasjon atde første spermatider i pupal testiklene passerer gjennom HP veksle mellom 24 og 48 hr APF 12.
Protokollen presenteres beskriver disseksjon av testiklene og cyster fra Drosophila puppe, forholdene kultur, og en farmakologisk analysen med intakte pupal testiklene. For dette formål er pupal testiklene på rundt 24 timer etter at dannelsen puparium (APF) dissekert (se figur 1 og 2). På dette tidspunkt har testiklene ikke gjort forbindelser til andre vev og er omgitt av bare en tynn ytre kappe, som gjør det mulig bedre gjennomtrengning av de hemmende forbindelsene 23,24. Testiklene er bean- eller pæreformede organer som lett kan tas i kultur. Disse prøvene blir dissekert, dyrket og behandlet med spesifikke inhibitorer. Deretter blir virkningene av inhibitorene overvåket ved hjelp av immunfluorescens analyser og fluorescens mikroskopi av fusjonsproteinet ekspresjon, og ved sammenligning av det nukleære morphollogi av de behandlede kjønnsceller til ubehandlede kimceller. Forholdene som presenteres i denne protokollen også tillate direkte avbildning av å utvikle testikler og bakterie linjer cyster på kultur.
Den presenterte protokollen beskriver to forskjellige applikasjoner basert både på evnen til å dissekere Drosophila testikler og enkelt bakterie-linje cyster ved en gitt utviklingsstadiet og på den ex vivo-utvikling av disse celler og vev i en dyrkningsskål. En anvendelse er den farmakologiske manipulering av vitale prosesser i løpet av utvikling av spermiene. Viktigst av alt gir dette tilgang til post-meiotisk spermatogenese som ikke er lett fått hjelp av funksjonelle analyser basert på flue genetikk. Det andre programmet er det mikroskopiske observasjon av levende og utvikle kjønnsceller og testikler. Spesielt dette programmet fordeler fra muligheten av Drosophila celler og organer i kultur for å overleve og utvikle seg på RT og under normal atmosfære. Derfor er tilstrekkelig til å oppnå meningsfulle resultater i rund-avbildnings eksperimenter en invertert avbildning mikroskop utstyrt med et oppvarmet trinn (oppvarming til standard avl temperatur på 25 ° C). Lengermer, mange transgene flue stammer som uttrykker fluorescerende protein-merket proteiner for direkte avbildning eksisterer eller lett kan etableres.
For å få pupal testikler eller bakterie linjer cyster av et bestemt utviklingsstadiet, er det avgjørende at man er kjent med timingen av Drosophila utvikling. Den eksakte tidspunktet for hvert trinn kan variere mellom laboratorier, kultur forhold, og fly stammer og må etableres empirisk. Som beskrevet ovenfor, er dette spesielt viktig for farmakologiske analyser som, for eksempel, er rettet mot HP bryteren. For slike eksperimenter, er det lurt å alltid se etter spermatider med en ProtamineB-EGFP signal før selve inhibitor test fordi timingen kan variere litt selv innenfor en populasjon.
Etter protokollen ovenfor bør sette eksperimentator å dissekere testiklene fra tidlige pupal stadier som intakte organer gratis festet fett kroppsvev. Disse testes og, enda mer så, isolert germ linjer cyster er svært skjøre. Derfor er det avgjørende å utvikle fingerferdighet og erfaring som er nødvendig for håndtering og overføring av testikler og cyster ved hjelp av tang, nåler, og pipetter. Spesielt studier rettet meiotisk og tidlig post-meiotisk bakterie-celle utvikling ville ha nytte av dette. Mens det er relativt enkelt å dissekere cyster av sen spermatider med lange flageller fra voksne testiklene, er det vanskelig å få tidligere stadier. Dissekere disse cyster fra tidlige pupal testiklene følger denne protokollen er mye mer effektiv. Husk at i et vanlig fly belastning, vil bare ca 50% av puppe være mann. Derfor, forberede seg til å dissekere minst dobbelt så mange pupper som antall testiklene nødvendig. Alternativt er det mulig å identifisere hann L3-larver ved hjelp av et stereo-mikroskop, som testes kan identifiseres som gjennomskinnelig rund organer er innebygd i den laterale fett kroppens vev av intakt larve 23,34, og for å samle dem i fersk kultur som ampuller kanbrukes til å plukke pre-puppe for regi og disseksjoner. Det er også mulig å identifisere hann pre-puppe 35.
Vi la merke til at begge de isolerte bakterie linjer cyster og de intakte pupal testiklene i kultur er følsomme for lys, så har også tidligere 18 rapportert. Dette lysfølsomheten kan også holde for noen kjemiske forbindelser som brukes i farmakologiske analyser. Derfor er det best å holde de kultur retter av en måling i mørket i løpet av inkuberingen. På samme måte, når du planlegger time-lapse bildebehandling eksperimenter med utviklings testikler og, spesielt, isolerte cyster, husk at for lange eksponeringstider og / eller altfor høye priser prøvetaking kan hemme ex vivo utvikling. Den riktige samplingsfrekvens bør bestemmes eksperimentelt.
Bakteriell og / eller fungal infeksjon og over-vekst i kultur retter utgjør et alvorlig problem. Infiserte kultur retter med for mange bakterier støtter ikke ex vivo develing av testiklene og cyster. Derfor inneholder den beskrevne kulturmedium penicillin og streptomycin (se trinn 1.1), men ved langtids inkubasjon, kan disse antibiotika bli degradert og deres aktivitet kan avta. Dette kan være en av årsakene til den begrensede tiden for overlevelse (maks. 72 timer) av dyrkede cyster som observeres ved bruk av protokollen ovenfor. Likevel er denne tidsperiode ikke kunne bli forlenget ved regelmessig utskifting av kulturmediet i rettene. Vi konkluderer med at andre faktorer kan påvirke overlevelsen i kultur, som for eksempel en mangel på vekstsignaler fra andre vev i kjønnsorganene. På den annen side er raskere i Drosophila enn i pattedyr etter meiotisk utvikling. I Drosophila, tar spermiogenesen ca 90 timer, og HP switch finner sted mellom 50 og 60 timer etter meiose 9,12. Dermed er de vanlige overlevelsestid på ca 48 timer oppnås med denne protokoll godt egnet til å følge sentrale utviklingsmessige prosesser i spermatogenesis, for eksempel meiotisk divisjoner eller HP-bryteren. Selv om bakteriell eller soppsporer kan unngås ved å bruke rene verktøy og medier, gjør present protokollen ikke gjøre bruk av strengt sterile arbeidsforhold fordi fluer og flue testiklene allerede inneholde bakterier når reist under standardbetingelser. Likevel kan noen programmer av denne kulturen teknikken nytte fluer dissekert eller hevet under aseptiske forhold (for protokoller, se 17,36,37).
Farmakologiske tester er avhengig av bruk av kjemiske forbindelser som virker som inhibitorer eller aktivatorer av forskjellige enzymer. Forbindelsene som vanligvis brukes i slike forsøk ofte variere mye i sine mål spesifisitet. Som en fordel, tilbyr dette potensial til å målrette hele enzym klasser, for eksempel med anacardic syre hemmer P300 / CBP, PCAF og MYST familiemedlemmer av HATS 38. Ulempen med dette kan være potensielle off-target eller cytotoksiske effekter Induktaed av slike forbindelser. Derfor bør hver forbindelse anvendes i en analyse med pupal testikler eller cyster bli testet for sin cytotoksisitet og spesifikk effekt ved forskjellige konsentrasjoner. Videre kan små variasjoner i de dyrkningsbetingelser, sammensatte konsentrasjon eller aktivitet, og variasjoner i cellen permeabilitet føre til variabilitet av de induserte effekter. Derfor er det nødvendig å måle effekten av behandlingen i hvert eksperiment. For eksempel når vi brukte anacardic syre på 150 mikrometer, observerte vi liten variasjon i styrken på kromatin kondens fenotype mellom og noen ganger i løpet av noen testikler, mens acetylering av histoner H4 var konsekvent redusert.
Farmakologiske analyser med Drosophila testikler i kultur har blitt brukt til å analysere pre-og post-meiotisk mekanismer av spermatogenesen 4,12,14,21. Siden det er vanskelig å få tilgang til post-meiotisk spermatogenese med genetiske verktøy for å målrette spillere med Essential pre-meiotisk og meiotisk funksjoner, utgjør dette ex vivo tilnærming et alternativ. Videre, i prinsippet, idet fremgangsmåten kan tilpasses til puls-chase eksperimenter for å følge utviklingen av behandlede kimceller over tid. Imidlertid har vi ennå ikke testet denne muligheten. Å gjøre bruk av tidlig pupal testiklene er en fordel i farmakologiske analyser. Først kan den tynne ytre kappe av de unge pupal testiklene (rundt 24 timer APF) gi økt permeabilitet av kjemiske forbindelser. For det andre, når man studerer post-meiotisk HP switch, pupal testiklene dissekert på 24 timer APF fra Protamine-GFP-uttrykke snøret muliggjøre en direkte avlesning av om HP bryteren var påvirket eller ikke.
Hittil har flere protokoller for ex vivo dyrking av Drosophila organer og vev inkludert testikler og bakterie linjer cyster blitt utviklet (se for eksempel 4,14,17,20,39,40). Dyrkingen medium og de generelle vilkår som benyttesi protokollen som presenteres her ble etablert i 1979 17. Kulturen systemet ble senere tilpasset in vivo avbildning av individualisering mekanismen i slutten av post-meiotisk cyster isolert fra voksne testiklene fire. Tidligere har vi rapportert at disse forholdene også støtte overlevelse og differensiering av meiotisk og tidlig post-meiotisk kjønnsceller i sine cyster for rundt 48 hr 12. I motsetning til andre kultursystemer 19 den observerte utviklings timing i disse kulturene var om lag lik timingen bestemmes fra faste prøver (for detaljer, se 12). H2AvD-RFP og Protamin-GFP fluorescens-signaler kan anvendes for å visualisere det nukleære kromatin morfologi og sammensetning av kjønnsceller i kultur. Vi fant at for entydig identifikasjon av utviklingsstadier i kultur, er dette en fordel i forhold til andre kriterier, for eksempel coiling av cyster. Viktigere, ikke fremlagt protokoll ikke innebære tillegg av fly extRACT eller andre vekst andre enn føtalt bovint serum faktorer. Videre viser vi her at forholdene er kompatibel med fluorescens mikros avbildning av meiotisk divisjoner ex vivo på kultur. Bilder kan fås med rimelig oppløsning i en lett-å-bruke medium som støtter langsiktig utvikling. Dette er i motsetning til protokoller slik kortsiktig (ca. 3 timer) observasjoner i Voltalef olje 41,42.
Prosedyrene som er beskrevet ovenfor for dyrking og farmakologisk behandling av pupal testikler og enkelt mannlige bakterie linjer cyster kan enkelt tilpasses til mange genetiske, epigenetisk, cellebiologiske, eller utviklings spørsmål som kan bli undersøkt i Drosophila spermatogenesen. Dette omfatter særlig forskning med fokus på bakterie-linje stamceller. Det har vist seg at stamcelle utvikling kan følges via direkte avbildning av kultivert voksen testiklene 20,43. Men den peristaltiske bevegelsen av det modne testis slireh forstyrrer bildet oppkjøpet. Derfor er enten avbildning gjort ved hjelp av fragmenterte testiklene 43 eller antall bilde eksperimenter utført må økes for å ta høyde for tapte datasett 20. Tidlig pupal testiklene (24 hr APF) er ennå ikke vedlagt muskelceller. Selv litt eldre testiklene (36-45 hr APF) synes å vise noen peristaltiske bevegelser (sammenlign figur 3 og Supplemental video 1). Derfor kunne dyrking av unge pupal testiklene som intakte organer tjener som et alternativ.
Videre, når de mestrer, evnen til å dissekere pupal testiklene og til slutt isolert bakterie-linje cyster vil tillate ytterligere programmer ved hjelp av enkle cyster som en kilde til en homogen, om enn liten, cellepopulasjon. For eksempel er det således mulig å utføre RT-qPCR å analysere den transkripsjonelle regulering av spesifikke gener under definerte faser av spermatogenese, som det allerede er vist <sup> 15.
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.
Anacardic acid | Merck Millipore | 172050 | brand: Calbiochem (EMD Millipore) |
Anti-acetyl-Histone H4 | Merck Millipore | 06-598 | brand: Upstate |
AxioCam MRm | Zeiss | ||
AxioObserver.Z1 inverted microscope | Zeiss | ||
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
Dumont 5-Inox forceps | Dumont | multiple suppliers | |
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Sigma | F4135 | |
Fiber optical illuminator | multiple suppliers | ||
Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5 | Dianova | 711-175-152 | |
Hoechst | Sigma | B1155 | |
Inoculation loop or pin holder | multiple suppliers | ||
Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0 | Plano GmbH | N5018 | In our hands both these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter. |
Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm | Plano GmbH | N5014 | |
Multiwell plates, 24-wells | Becton Dickinson | 351147 | brand: Falcon |
Pen Strep | invitrogen | 15070 | brand: Gibco |
Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma | S8398 | |
Stemi SV6 binocular | Zeiss |