This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.
Under spermatogenes hos däggdjur och Drosophila melanogaster, manliga könsceller utvecklas i en rad viktiga utvecklingsprocesser. Detta inkluderar differentiering från en stamcellspopulation, mitotiska förstärkning och meios. Dessutom efter meiotiska könsceller genomgå en dramatisk morfologisk omformning processen samt en global epigenetisk omkonfigurering av groddlinjen kromatin-histon till protamin omkopplare.
Att studera rollen av ett protein i post meiotisk spermatogenes använder mutagenes eller andra genetiska verktyg hindras ofta av avgörande embryonala, pre-meiotisk eller meiotiska funktioner proteinet under utredning. Den post-meiotisk fenotyp av en mutant av ett sådant protein kunde skymmas genom ett tidigare utvecklings blocket, eller tolkning av fenotyp kan vara komplicerat. Den modellorganism Drosophila melanogaster erbjuder en bypass på detta problem: intakta testiklar ochäven cystor av könsceller dissekerade från tidig puppor kan utveckla ex vivo i odlingsmedium. Att använda sig av sådana kulturer möjliggör mikroskopisk avbildning av levande könsceller i testiklarna och i grodden linjer cystor. Viktigt är de odlade testiklar och könsceller blir också tillgänglig för farmakologiska hämmare, varigenom manipulering av enzymatiska funktioner under spermatogenes, inklusive post meiotiska etapper.
Protokollet presenteras beskriver hur man dissekera och odla PUPP testiklar och grodden-line cystor. Information om utvecklingen av PUPP testiklar och odlingsbetingelser finns vid sidan av mikroskopbilddata av levande testiklar och grodden-line cystor i kultur. Vi beskriver också en farmakologisk analys för att studera efter meiotisk spermatogenes, exemplifierad av en analys med inriktning på histon till protamin switch med hjälp av histonacetyltransferas hämmaren anacardic syra. I princip skulle denna odlingsmetod anpassas för att hantera många ovriga forskningsfrågor i före och efter meiotisk spermatogenesen.
Utvecklingen av manliga könsceller hos många arter är en sekventiell process. Den kännetecknas av en rad avgörande händelser som kulminerar i bildandet av morfologiskt och epigenetiskt högt specialiserad spermier. I Drosophila melanogaster, grodd-line stamceller vid spetsen av testikel klyftan asymmetriskt för att ge upphov till en ny stamcell och spermatogonium, dvs dottercell som har åtagit sig att differentiering (se figur 1 för en översikt) 1,2 . Den spermatogonium genomgår fyra rundor av mitotiska motsättningar och med uppkomsten av meios, en fas med imponerande tillväxt och transkriptionsaktivitet som kallas spermatocyte stadiet. Cellerna ursprung från en spermatogonium förblir anslutna till varandra och utvecklas som en synkroniserad bunt lindade med två somatiska celler-en struktur kallad en cysta. Efter slutförandet av meios, är morfologin hos de manliga könsceller heltomorganiseras (schematiskt visad i figur 1). Initialt runda spermatider elongate att bilda den hydrodynamiska huvudstruktur och flagellum utvecklas. Så småningom är spermierna separeras från varandra genom en komplex, apoptos-relaterade mekanism kallas individualisering 3-5.
I många arter, inklusive Drosophila melanogaster och däggdjursarter, de morfologiska förändringar av könsceller åtföljs av en anmärkningsvärd epigenetisk ombildning av det haploida manliga könsceller-line kromatin, kallad histon till protamin switch (HP switch) 6-9. Möjligen nästan alla kanoniska histon och många histon-variantmolekyler strippad från DNA och ersätts av små basiska proteiner, de protaminer, vilket resulterar i mycket kompakta nucleoprotamine struktur specifik för kromatin mogna spermier. Allmänna egenskaper hos HP switch är than ersättning av kanoniska histoner först med histon varianter, därefter av övergångs proteiner, och slutligen av protaminer. Allt detta åtföljs av flera ändringar epigenetiska märken, såsom ett uppsving i acetylering nivåer histon H4 precis före histon borttagning 7,10 – 12.
De flesta, om inte alla, av de ovan nämnda processer är avgörande för utvecklingen av mogna, fullt fertila spermier. Detta är sant inte endast i Drosophila utan också i människor, såsom däggdjurs spermatogenes delar en avsevärd mängd av likhet med det ryggradslösa systemet 1,8,9. Studera manliga bakteriefri cellsutveckling underlättas i hög grad i Drosophila modellsystem. Flugor är genetiskt mycket lättillgänglig. Den generation av mutanter samt inrättandet av flyga stammar som uttrycker fusionsgener eller RNA interferens konstruktioner tar lite ansträngning. Men i studien av post-meiotisk spermatogenes, användning av mutanter end enkla genetiska verktyg kunde nå en gräns. I Drosophila spermatogenes upphör transkription nästan helt med inträde i meiotiska divisioner. Således efter meiotisk spermatogenes främst baserad på translation förtryckta och lagrade mRNA syntetiseras i en utökad meiotisk profas 13-16. Därför verktyg som RNA-interferens eller användning av icke-villkorliga mutanter är inte lämpliga för att studera specifikt efter meiotiska roller genprodukter som också fyller viktiga funktioner i pre-meiotisk eller meiotisk könscell utveckling.
En fördel med Drosophila som kan utnyttjas i sådana fall är möjligheten för dissekerade intakta testiklar och även cystor av könsceller att utveckla ex vivo i odlingsmedium 4,12,17 – 20. Den dissekering och odling av testiklar eller bakterie-linje cystor gör inte bara mikroskopisk observation av bakterie-cellutveckling i levande celler, men enlso användning av farmakologiska analyser med, t.ex. hämmare av enzymkomplex såsom histon acetyltransferaser (hattar), histondeacetylaser (HDAC), topoisomeraser eller proteasomen. Således är det möjligt att manipulera enzymatiska funktioner under efter meiotisk spermatogenes och övervaka de utvecklingsresultat oavsett embryonala, pre-meiotiska eller meiotiska funktioner 4,12.
I farmakologiska analyser, tidigare analyserade vi acetylering beroende lokalisering av ett bromodomain protein under meiotisk profas samt relevansen av histonacetylering nivåer för den epigenetiska HP switch i post-meiotisk spermatogenesen genom att använda specifika hämmare riktar hattar och HDAC 12,21. Inriktning HP switch i dessa analyser gjordes möjligt genom att använda en fluga stam som uttrycker fusionsgener histone2AvD-RFP och protamineB-EGFP 12,22 i de endogena mönster och observationen attde första spermatider i PUPP testiklar passerar HP växla mellan 24 och 48 timmar APF 12.
Protokollet presenteras beskriver dissektion av testiklar och cystor från Drosophila puppor, odlingsförhållanden, och en farmakologisk analys med intakta PUPP testiklar. För detta ändamål är PUPP testiklar vid omkring 24 h efter puparium bildning (APF) dissekerades (se figurerna 1 och 2). Vid denna tid, har testiklarna inte gjort kopplingar till andra vävnader och är omgivna av endast ett tunt yttermantel, vilket möjliggör bättre penetration av inhibitorföreningar 23,24. Testiklarna bean- eller päronformad organ som lätt kan tas i kultur. Dessa testiklarna dissekeras, odlade, och behandlas med specifika hämmare. Därefter effekterna av inhibitorer övervakas med immunofluorescens analyser och fluorescensmikroskopi fusionsproteinuttryck, och genom jämförelse av kärn Morpholnik för de behandlade groddceller till den för obehandlade könsceller. De villkor som presenteras i detta protokoll tillåter också levande avbildning utveckla testiklar och grodden linjer cystor i kultur.
Den presenterade protokollet beskriver två olika applikationer baserade både på förmågan att dissekera Drosophila testiklar och enstaka bakterie-linje cystor vid ett givet utvecklingsstadium och på ex vivo utvecklingen av dessa celler och vävnader i en odlingsskål. En ansökan är den farmakologiska manipulation av vitala processer under utvecklingen spermier. Viktigt ger denna tillträde till högre meiotisk spermatogenes som inte är lätt vunnit med hjälp av funktionsanalyser baserade på fluga genetik. Det andra programmet är mikroskopisk observation av levande och utveckla könsceller och testiklar. Speciellt denna applikation nytta förmåga Drosophila celler och organ i kultur att överleva och utvecklas vid RT och under normal atmosfär. Därför är tillräcklig för att erhålla meningsfulla resultat i levande-imaging experiment en inverterad avbildning mikroskop utrustat med en uppvärmd skede (uppvärmning till standard avel temperatur av 25 ° C). Vidarefler, många transgena flyga stammar som uttrycker fluorescerande protein-taggade proteiner för levande avbildning existerar eller kan lätt fastställas.
För att få PUPP testiklar eller bakterie-linje cystor av någon särskild utvecklingsstadium, är det viktigt att man känner till tidpunkten för Drosophila utveckling. Den exakta tidpunkten för varje etapp kan variera mellan laboratorier, odlingsbetingelser och flyga stammar och måste fastställas empiriskt. Som beskrivits ovan är detta särskilt viktigt för farmakologiska analyser som till exempel riktar HP switch. För sådana experiment, är det lämpligt att alltid kontrollera om spermatider med ProtamineB-EGFP signalen innan det verkliga provet hämmaren eftersom tidpunkten kan variera något även inom en population.
Efter protokollet ovan skulle göra det möjligt för försöksledaren att dissekera testiklar från tidiga PUPP stadier som intakta organ fria från vidhängande fett kroppsvävnad. Dessa testiklar och, ännu mer, isolerade GErm-line cystor är mycket bräcklig. Därför är det viktigt att utveckla fingerfärdighet och erfarenhet som krävs för att hantera och överföra testiklar och cystor Använd pincett, nålar och pipetter. Speciellt studier inriktade meiotisk och tidig post meiotisk bakteriefri cell utveckling skulle gynnas av detta. Även om det är förhållandevis lätt att dissekera cystor av sena spermatider med långa flageller från vuxna testiklar, är det svårt att få tidigare skeden. Analysera dessa cystor från tidiga PUPP testiklar efter detta protokoll är mycket effektivare. Tänk på att i en vanlig fluga stam, kommer endast ca 50% av puppor vara man. Därför förbereder sig för att dissekera minst dubbelt så många puppor som antalet testiklarna krävs. Alternativt är det möjligt att identifiera manliga L3 larver med hjälp av ett stereomikroskop, eftersom testiklarna kan identifieras som genomskinliga runda organ inbäddade i de laterala vävnader i intakta larven 23,34 fett kropp, och att samla dem i färskt odlingsflaskor som kananvändas för att plocka pre-puppor för stadieindelning och dissektioner. Det är också möjligt att identifiera manliga pre-puppor 35.
Vi märkte att både de isolerade bakterielinje cystor och de intakta PUPP testiklar i kultur är känsliga för ljus, vilket också har tidigare 18 rapporterats. Denna ljuskänslighet kan också hålla för vissa kemiska föreningar som används i farmakologiska analyser. Därför är det bäst att hålla odlingsskålarna av en assay i mörker under inkubation. Likaså när man planerar tidsförlopp imaging experiment med utvecklings testiklar och, framför allt, isolerade cystor, tänk på att alltför långa exponeringstider och / eller alltför höga samplingsfrekvenser kan hämma ex vivo utveckling. Den lämpliga samplingshastighet bör bestämmas experimentellt.
Bakteriell och / eller svampinfektion och över-tillväxt i odlingsskålarna utgör ett allvarligt problem. Infekterade kultur rätter med för många bakterier stöder inte ex vivo utvecklingen av testiklarna och cystor. Därför innehåller det beskrivna odlingsmediet penicillin och streptomycin (se steg 1.1), men under långvarig inkubering kan dessa antibiotika degraderas och deras aktivitet skulle kunna minska. Detta kan vara en av orsakerna till den begränsade tiden för överlevnad (max. 72 timmar) av odlade cystor observerats vid användning av protokollet ovan. Yet denna tidsram kunde förlängas genom regelbunden ersättning av odlingsmediet i varje skål. Vi drar slutsatsen att andra faktorer kan påverka överlevnaden i odling, till exempel en brist på tillväxtsignaler från andra vävnader i könsorganen. Å andra sidan, är post-meiotisk utveckling snabbare i Drosophila än i däggdjur. I Drosophila, tar spermiogenesen cirka 90 timmar, och HP switch äger rum mellan 50 och 60 timmar efter meios 9,12. Således är den vanliga levnadstid på ca 48 h uppnås med detta protokoll väl lämpad att följa centrala utvecklingsprocesser i spermatogenesis såsom meiotiska divisioner eller HP switch. Även bakteriell eller svampkontamination kan undvikas genom att använda rena verktyg och medier, ser fram protokollet inte använda strikt sterila arbetsförhållanden eftersom flugor och flyga testiklar redan innehåller bakterier när höjas under standardförhållanden. Ändå kan vissa tillämpningar av denna kultur teknik gynnas flugor dissekerade eller till och med höjas under aseptiska förhållanden (till protokoll, se 17,36,37).
Farmakologiska analyser beror på användningen av kemiska föreningar som verkar som hämmare eller aktivatorer av olika enzymer. Föreningarna som vanligtvis används i sådana experiment skiljer sig ofta mycket i deras mål specificitet. Som en fördel, erbjuder detta möjligheter att rikta hela enzymklasser, till exempel med anacardic syrahämmande p300 / CBP, PCAF och MYST familjemedlemmar HATs 38. Nackdelen med detta kan vara potentiellt utanför mål eller cytotoxiska effekter Induced av sådana föreningar. Därför bör varje förening som används i en analys med PUPP testiklar eller cystor testas för dess cytotoxicitet och specifik effekt vid olika koncentrationer. Vidare kan små variationer i odlingsbetingelserna, förening koncentration eller aktivitet, och variationer i cellens permeabilitet leder till variabilitet i de inducerade effekter. Därför är det nödvändigt att övervaka framgången för behandling i varje experiment. Till exempel när vi använde anacardic syra vid 150 iM observerade vi smärre variationer i styrkan i kromatinkondensation fenotyp mellan och ibland inom några testiklar, medan acetylering av histon H4 konsekvent minskat.
Farmakologiska analyser med Drosophila testiklar i kultur har använts för att analysera före och efter meiotiska mekanismer spermatogenes 4,12,14,21. Eftersom det är svårt att få tillgång till post-meiotisk spermatogenes med genetiska verktyg för att rikta spelare med essential för-meiotiska och meiotiska funktioner, utgör denna ex vivo tillvägagångssätt ett alternativ. Vidare, i princip den metod skulle kunna anpassas till puls-chase experiment för att följa utvecklingen av behandlade groddceller över tiden. Vi har dock ännu inte testat denna möjlighet. Att använda sig av tidig pupal testiklarna är en fördel i farmakologiska analyser. För det första kan den tunna yttermantel av de unga PUPP testiklar (cirka 24 tim APF) möjliggör förbättrad permeabilitet av kemiska föreningar. För det andra, när man studerar den post meiotiska HP switch, de PUPP testiklar dissekerade vid 24 h APF från Protamin-GFP-uttryck lina möjliggöra en direkt avläsning av om HP switch påverkades eller inte.
Hittills har flera protokoll för ex vivo odling av Drosophila organ och vävnader inklusive testiklar och grodden-line cystor utvecklats (t.ex. se 4,14,17,20,39,40). Odlingen medium och de allmänna villkor som användsi protokollet presenteras här etablerades 1979 17. Odlingssystemet anpassades senare till in vivo avbildning av individualisering mekanismen i sena post meiotiska cystor isolerade från vuxna testiklar 4. Tidigare har vi rapporterat att dessa villkor stöder också överlevnad och differentiering av meiotisk och tidiga post-meiotiska könsceller i sina cystor för cirka 48 timmar 12. Till skillnad från andra odlingssystem 19 den observerade utvecklings timing i dessa kulturer var ungefär i linje med tidpunkten bestäms av fasta prover (för detaljer, se 12). H2AvD-RFP och Protamin-GFP fluorescens signaler kan användas för att visualisera den nukleära morfologi och kromatin sammansättning könsceller i kultur. Vi fann att för tydlig identifiering av utvecklingsstadier i kultur, det är en fördel jämfört med andra kriterier, såsom ringlande av cystor. Viktigt är den presenterade protokollet inte innebära tillsats av flyg extract eller andra än fetalbovinserum tillväxtfaktorer. Dessutom visar vi här att villkoren är förenliga med fluorescensmikroskopi avbildning av meiotiska divisioner ex vivo i kultur. Bilder kan erhållas med rimlig upplösning i ett lättanvänt medium som stödjer långsiktig utveckling. Detta står i kontrast till protokoll som möjliggör kortsiktiga (ca 3 h) observationer i Voltalef Olja 41,42.
De förfaranden som beskrivs ovan för odling och farmakologisk behandling av PUPP testiklar och enda manliga grodden-line cystor är lätt att anpassa till många genetiska, epigenetiska, cellbiologiska, eller utvecklings frågor som kan undersökas i Drosophila spermatogenes. Detta innefattar särskilt forskning med fokus på grodden linjer stamceller. Det har visat sig att stamcellsutveckling kan följas av levande avbildning av odlade vuxna testiklar 20,43. Emellertid den peristaltiska rörelsen i det mogna testikel mantelh stör bilden förvärvet. Därför är antingen avbildning görs med hjälp av fragmente testiklar 43 eller antalet imaging experiment utförda måste ökas för att ta hänsyn till förlorade datamängder 20. Tidiga PUPP testiklar (24 hr APF) är ännu inte bifogas muskelceller. Även lite äldre testiklar (36-45 tim APF) tycks visa några peristaltiska rörelser (jämför figur 3 och Supple video 1). Därför kan odling av unga PUPP testiklar såsom intakta organ tjäna som ett alternativ.
Dessutom, när behärskar, förmågan att dissekera PUPP testiklar och slutligen isolerade grodden linjer cystor gör att ytterligare ansökningar, använder en cystor som källa till en homogen, om än liten, cellpopulation. Till exempel är det således möjligt att utföra RT-qPCR att analysera transkriptionell reglering av specifika gener under definierade stadier av spermatogenes, såsom redan har visats <sup> 15.
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.
Anacardic acid | Merck Millipore | 172050 | brand: Calbiochem (EMD Millipore) |
Anti-acetyl-Histone H4 | Merck Millipore | 06-598 | brand: Upstate |
AxioCam MRm | Zeiss | ||
AxioObserver.Z1 inverted microscope | Zeiss | ||
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
Dumont 5-Inox forceps | Dumont | multiple suppliers | |
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Sigma | F4135 | |
Fiber optical illuminator | multiple suppliers | ||
Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5 | Dianova | 711-175-152 | |
Hoechst | Sigma | B1155 | |
Inoculation loop or pin holder | multiple suppliers | ||
Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0 | Plano GmbH | N5018 | In our hands both these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter. |
Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm | Plano GmbH | N5014 | |
Multiwell plates, 24-wells | Becton Dickinson | 351147 | brand: Falcon |
Pen Strep | invitrogen | 15070 | brand: Gibco |
Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma | S8398 | |
Stemi SV6 binocular | Zeiss |